PrimeSTAR® DNA Polymerase 시리즈는 모두 high fidelity DNA polymerase의 표준인 Pfu DNA Polymerase보다 높은 정확도를 가지고 있습니다. 그 중에서도 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase(Code R045A)는 pUC119 vector 전체서열에 대해 PCR 증폭 후sequence 분석을 한 결과, 증폭된 370,656 염기 중 error는 단 4개로, 중 가장 높은 정확도를 가지고 있습니다. (error rate 0.00108%)

다음과 같은 순서로 PCR 반응에 최적의 효소를 선택합니다.

[첫번째]
높은 정확도와 강력한 증폭이 필요한 경우 PrimeSTAR® GXL DNA polymerase (Code R050A)의 사용을 권장합니다. GC 함량이 70%가 넘는 서열에서도 높은 정확도와 강력한 증폭이 가능합니다.

[두번째]
증폭시키려는 서열에 따라 TaKaRa LA Taq® with GC buffer (Code RR02AG)의 사용도 고려해야 합니다. TaKaRa LA Taq® with GC buffer 사용시에는 GC bufferⅠ을 우선 사용하고, GC bufferⅡ의 순서로 실험을 진행합니다. GC bufferⅠ은 긴 서열의 증폭이 가능하며, GC bufferⅡ는 증폭 size에 한계가 있지만 복잡하고 고차원적인 구조를 지닌 서열의 증폭에 효과적입니다.

높은 정확도의 6 kb 이상의 template의 증폭에는 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)의 사용을 권장합니다. 이 효소는 Human genomic DNA를 주형으로 했을 때, 30 kb의 증폭까지 가능합니다. 이 효소 이외에도 높은 증폭 효율이 필요할 경우 TaKaRa LA Taq® (Code RR002A)의 사용을 권장합니다.

PrimeSTAR® Max DNA Polyerase (Code R045A), PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A), SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Code RR350A)의 사용을 권장합니다. PrimeSTAR® Max DNA Polymerase는 신장인자를 포함하여 신장속도가 5s / kb로 세계 최고 수준의 합성속도를 가지고 있습니다. PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase는 고속 PCR 프로토콜(효소량 2배) 적용시 10~20초 / kb로 신장시간을 줄일 수 있기 때문에, 긴 template도 단시간에 증폭이 가능합니다. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix는 10s / kb의 신장속도로 PCR 증폭이 가능합니다.

Intron을 포함한 genome DNA 등 AT 함량이 높을 것으로 예상되는 template의 증폭에는 TaKaRa Ex Taq® (Code RR001A), TaKaRa LA Taq® (Code RR002A), PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)의 사용을 권장합니다. 특히, 높은 정확도가 요구되는 실험에서는 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase를 사용하면 뛰어난 증폭과 높은 정확도를 얻을 수 있습니다.

TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfate-treated DNA) (Code R110A)의 사용을 권장합니다. 이 효소는 마그네슘 농도, dNTP 농도 조절 등 버퍼의 조성을 최적화하여 증폭이 어려웠던 template에 대해서도, 우수한 반응 특이성과 높은 증폭효율로 증폭이 가능합니다.
또한, Methylation Specific PCR (MSP) 분석을 진행 할 경우 MSP 전용시약인 EpiScope MSP Kit (Code R100A)의 사용을 권장합니다.

증폭하려는 샘플에 PCR 저해 물질이 많아 일반적인 PCR 효소로 증폭이 되지 않은 경우에는 MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.2 (Code R071A)와 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)의 사용을 권장합니다. MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.2는 혈액, 식물조직 등에서도 우수한 증폭이 가능합니다. 또한 높은 정확도가 요구된다면 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase의 사용을 추천합니다. 표준 Protocol로도 증폭이 가능하지만, 효소량을 2배 사용한다면 반응성이 더욱 개선됩니다. 만약 위의 효소를 사용하였지만 증폭이 되지 않는다면, 증폭 샘플의 순도를 높여야 합니다.

MightyAmp™ for FFPE (Code R073A)의 사용을 추천합니다. MightyAmp™ for FFPE 제품에는 paraffin embedded tissue에서도 효율적인 DNA 추출을 위한 시약도 포함되어 있습니다. 높은 정확도를 요구하는 경우, PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)의 사용도 가능합니다.

Premix 형태로 PCR 반응액을 만들기 쉽고, PCR 증폭 후 바로 Agarose gel에 첨가하여 전기영동을 할 수 있는 제품인 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Code RR310A), EmeraldAmp® PCR Master Mix (Code RR300A), SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Code RR350A)의 사용을 권장합니다. EmeraldAmp® PCR Master Mix는 고성능 타입으로, GC/AT 함량이 높은 서열에 관계없이 다양한 길이의 template의 증폭이 가능합니다. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix는 Fast PCR이 가능하여, 빠르게 결과를 확인 할 수 있습니다.

균체의 양에 크게 영향을 받지 않는 EmeraldAmp® PCR Master Mix (Takara code RR300) , EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Takara code RR310)을 권장합니다.

3′→5′exonuclease 활성을 가지는 PCR용 효소(PrimeSTAR® DNA polymerase Series, TaKaRa Ex Taq®, TaKaRa LA Taq® 등)를 사용할 경우, inosine이 포함된 primer를 사용하면 반응성이 현저하게 감소합니다. 혼합 primer가 필요한 증폭에는 degenerated primer를 사용합니다. 또한 TaKaRa Taq™ (Code R001A), TaKaRa Taq™ hot start version (Code R007A)은 inosine을 포함한 primer를 사용할 수 있습니다.

Multiplex PCR Assay Kit Ver.2 (Code RR062A)의 사용을 권장합니다. Primer design 및 반응 조건의 최적화 등 복잡한 과정을 필요로 하지 않으며, 최소한의 조건 검토로 multiplex PCR을 할 수 있도록 준비 된 제품입니다.

효소의 종류에 따라 다음과 같이 cloning 실험을 진행합니다.

PrimeSTAR® DNA polymerase 시리즈를 사용한 경우
PrimeSTAR® DNA polymerase 시리즈는 강력한 3′→5′exonuclease 활성을 가지고 있어, 증폭된 산물 대부분이 평활말단이 되며, Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR® (Code 6019)을 사용하여 TA cloning을 합니다.

PrimeSTAR® DNA polymerase Series 이외의 경우,
TaKaRa Taq™, TaKaRa Ex Taq®, TaKaRa LA Taq®, SpeedSTAR™ HS DNA polymerase를 사용한 증폭 산물 대부분은 3′말단에 dA가 돌출된 형태로 존재하기 때문에 T vector로 cloning이 가능합니다. 또한, 증폭 산물을 Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (Code 6027)을 사용하여 평활말단화 후, 평활말단 vector에 cloning이 가능합니다.

아래 사항을 참고하여 Primer를 디자인하여 주시기 바랍니다.

일반적으로는 20∼25 mer의 Primer를 권장합니다(Size가 큰 PCR 산물을 증폭할 경우에는 25∼30 mer의 primer에서 좋은 결과가 나오는 경우가 있습니다). Forward primer와 reverse primer가 서로 상보적인 서열을 가지지 않아야하며, 특히 3′말단에서 3염기 이상 상보적인 서열이 되지 않도록 주의합니다.

Primer는 GC 함량이 50∼60%가 되도록 디자인하고, 부분적으로 GC 또는 AT rich가 되지 않도록 합니다. 또한 template DNA와 안정적으로 annealing 할 수 있도록 primer의 3′말단은 AT rich가 되지 않도록 합니다.

Primer 내에서 2차 구조가 형성되는 것을 방지하기 위해 상보적인 서열을 포함하지 않도록 주의합니다.

Forward primer와 reverse primer의 Tm값의 차이가 커지지 않도록 디자인합니다.

Genomic DNA나 plasmid DNA, transcript 등 사용하는 template 종류와 PCR반응에 사용되는 DNA polymerase의 종류 따라 PCR 실험에 적합한 template 양이 다릅니다. PrimeSTAR® HS DNA polymerase (Code R010A) 사용시 과량의 template가 PCR 증폭을 억제할 수 있으므로 주의합니다.
아래는 일반적인 template 권장량입니다. (50 ㎕ 반응시)

Human genomic DNA : 5∼200 ng
E. coli genomic DNA : 100 pg∼100 ng
cDNA library : 1∼200 ng
λDNA : 10 pg∼10 ng
Plasmid DNA : 10 pg∼1 ng