일반적인 plasmid vector의 ligation은 DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (Code 6023)의 사용을 권장합니다. DNA Ligation Kit <Mighty Mix>은 돌출말단 (Sticky-end)은 물론, 높은 효율을 얻기 어려운 평활말단 (Blunt-end) cloning이나 T-Vector cloning에도 높은 효율을 얻을 수 있습니다. 또한, 효소와 버퍼를 포함한 2X premix type으로 신속하고 간편하게 ligation 반응을 할 수 있습니다. 또한, freeze/thaw가 반복되면 효율이 저하되는 기존 ligation kit과는 달리, 50회의 freeze/thaw에도 높은 효율을 유지합니다.


그림1. DNA Ligation Kit (Code 6023)은 표준 protocol (16℃, 30분) 및 rapid protocol (25℃, 5분)을 각각 적용하였을 때, sticky end insert (A)와 blunt end insert (B)에 서 타사제품(D사) 대비 보다 많은 colony가 발생 한 것이 확인 되었다.


그림2. DNA Ligation Kit <Mighty Mix>를 사용한 Mighty TA-cloning Kit (Code 6028)와 타사제품의 효율 비교


그림3. 반복적인 Freeze/thaw에도 ligation 효율 저하는 관찰되지 않음

Plasmid에 도입할 수 있는 insert DNA의 size 는 몇 kb까지라는 제한은 없지만, size가 길어지면 ligation 효율이 저하되는 경향이 있습니다. TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (Code 6024)은 긴 insert의 DNA ligation에 최적화되어 있기 때문에, 10 kb 이상의 ligation을 실시하는 경우에도 높은 효율로 ligation이 가능합니다. 또한, insert DNA를 포함한 plasmid의 size가 커지면 (특히 10 kb를 넘으면) 대장균에의 도입 효율이 낮아지고, 대장균내에서 plasmid의 안정성도 저하되기 때문에 plasmid 결실 클론이 되는 경우가 발생합니다.
긴 plasmid의 DNA transformation에는 큰 size의 DNA를 효율적으로 transformation 할 수 있는 E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128), E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Code 9028)의 사용을 권장합니다.


그림4. 다양한 size의 정제 plasmid를 이용한 transformation 효율 비교

Takara DNA Ligation Kit LONG (Code 6024) 제품은 insert DNA의 길이가 수 kb 이하의 ligation에도 다른 제품과 비교하여 동등 혹은 이상의 효율을 보여줍니다. 하지만, Takara DNA Ligation Kit LONG 제품은 반응시간이 길고 premix 형태의 제품이 없기 때문에, 짧은 DNA의 ligation에는 DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (Code 6023)제품의 사용을 권장합니다.

DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (Code 6023)의 표준 반응시간은 반응시간은 16℃, 30분이며, 대부분의 ligation 반응에서는 이 조건으로 효율적인 ligation이 가능합니다.
그러나 평활말단 ligation 등, ligation이 어려운 경우에는 반응시간을 수 시간부터 하룻밤으로 늘 리는 것으로 ligation 효율이 증가되는 경우가 있습니다. 또한, 비교적 ligation이 간단한 돌출말단 ligation 등에서 반응시간을 단축하고 싶은 경우에는 25℃, 5분의 고속 프로토콜을 사용해도, 16℃, 30분의 표준 프로토콜과 동등한 ligation 효율을 얻을 수 있습니다.

일반적으로, ligation 반응 시간을 늘릴 것을 권장합니다.
또한, DNA 용액의 염 농도가 높으면 ligation 효율이 저하됩니다. 특히, 에탄올 침전시의 사용하는 아세트산 암모늄 염은 ligation의 반응을 저해하기 때문에, 에탄올 침전시 염이 남지 않도록 정제 과정을 실시해야 합니다.

Insert DNA를 Agarose gel로부터 잘라 정제할 때 UV 조사에 의해 DNA가 손상을 받을 수 있기 때문에, UV의 노출시간을 최소화합니다 (특히 300 nm 이하의 단파장 UV 조사시). 또한, 시판되는 agarose gel로부터 DNA를 추출하는 제품 중 column에서 용출액을 그대로 ligation에 이용하는 제품의 경우, 최종적으로 얻은 용출액을 에탄올 침전 후, buffer를 교환하면 ligation 효율이 개선되는 경우가 있습니다.

DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞ (Code 6023)를 사용하는 경우, ligation mix는 융해 후 반드시 pipette으로 잘 혼합하여 사용합니다. 잘 섞이지 않으면, 조성이 불균일하여 안정된 결과를 얻을 수 없는 경우가 발생할 수 있습니다.

Alkaline phosphatase로 탈인산화한 plasmid vector는 insert DNA의 5' 말단 인산기로 한쪽편의 사슬만 연결됩니다. 이 상태로 대장균에 transformation하면, 대장균의 DNA repair에 의해 Nick이 제거되어, 연결 된 plasmid 상태로 유지됩니다.