◆ Introduction
크로마틴면역침강법 (ChIP; chromatin immuno precipitation)은 목적 단백질이 결합되어 있는 염색체 영역을 면역침강법으로 농축 (enrichment)하는 기술이다. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-seq)은 농축한 영역을 Next Generation Sequencing (NGS)으로 분석하는 방법으로, 에피제네틱스 연구를 위한 필수적인 기술이다. ChIP-seq은 사용하는 세포의 수가 적고 ChIP으로부터 회수되는 DNA의 양이 매우 적어, 미량의 ChIP DNA 분석법을 확립하는 것은 매우 중요한 과제이다. 이에 따라, 본 연구자는 크로마틴 단편화 (Chromatin fragmentation)의 최적화 및 다카라바이오의 SMARTer^® ThruPLEX^® DNA-seq Kit을 이용하여, 미량의 ChIP DNA-seq 분석 기법을 확립하였다.

◆ 사용제품
SMARTer^® ThruPLEX^® DNA-seq Kit (Takara)

◆ Workflow


◆ NGS Mapping 결과
1x10⁴개 또는 2.5×10⁵개의 망막색소상피세포 (RPE)에서 H3K4me3 항체를 이용해 ChIP DNA 샘플을 얻었다. 면역 침강하지 않은 세포를 “Input” 샘플로 표기하였다. ChIP DNA 샘플의 전량을 이용해 SMARTer^® ThruPLEX^® DNA-seq Kit로 NGS Library를 제작하여 염기서열을 분석하였다. 1x10⁴개의 적은 세포 샘플에서 duplicate rate가 9.1%로 확인되었고 2.5×10⁵ 개 세포 샘플의 실험 결과와 유사하였다.

샘플	Total reads	Mapped reads	Unmapped reads	PCR Bias (duplicate)
Input	31,400,938	26,696,740 (78.7%)	3,087,220 (9.8%)	3,616,978 (11.5%)
1x104 세포 (H3K4me3)	30,823,404	21,336,878 (69.2%)	6,697,451 (21.7%)	2,789,075 (9.1%)
2.5x105 세포 (H3K4me3)	45,738,702	37,730,704 (82.5%)	4,018,338 (8.8%)	3,989,660 (8.7%)

◆ Peak 검출결과
1×10⁴ 세포로부터 얻은 H3K4me3의 peak profile은 2.5×10⁵ 세포의 결과와 유사함을 확인하였다.