인체는 수 조개의 세포로 구성되어 있으며, 각각의 세포는 서로 다른 수백개의 종류와 하위 분류로 구분된다. 이러한 세포를 대량으로 동시에 분석하는 것으로는 희귀한 생물학적 현상을 확인하기 어렵다는 것이 명백하게 밝혀지면서, 단일 세포 수준에서의 세포의 발달, 세포 계통 특성화, 종양 이질성 및 세포 다양성에 대한 분석의 중요성이 대두되고 있다.
연구자들은 single cell sequencing을 이용해 각각의 세포 역할을 확인할 수 있게 되었다. 하지만 대량 분석과는 달리 단일 세포가 가지는 RNA, DNA의 양이 제한적이기 때문에, cell direct protocol을 필요로 하며, 편향성 없는 coverage를 보이는 sequencing library를 제작하는 것 또한 매우 어렵다.
다카라바이오는 독자적인 SMART (Switching Mechanism at 5' end of RNA Template) 기술을 이용한 single cell direct protocol을 이용한 full-length의 정보를 가지는 library 제작 전 과정을 지원하고 있다.
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Single cell의 full-length 분석의 필요성과 application이 궁금하다면?
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Single Cell 분석의 연구동향
** 각 논문 내용은 요약되어 기술되어 있으며, 상세한 내용은 링크되어 있는 논문 원문을 확인해 주세요.
-> [Review] Aldridge, Sarah, and Sarah A. Teichmann. "Single cell transcriptomics comes of age." Nature Communications 11.1 (2020): 1-4.
최근 10년간의 single cell transcript의 분석 기술 발전을 다루고 있으며, 이에 적용되는 다양한 NGS 기술 뿐 아니라 DNA, protein을 함께 multi-omics함으로써 보다 심층적인 single cell 분석법을 소개하고 있다.
-> [Review] Kashima, Yukie, et al. "Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses." Experimental & Molecular Medicine 52.9 (2020): 1419-1427.
Single cell에서의 RNA, DNA, Protein 분석 기법과 이를 이용한 다양한 논문과 사례를 소개하고 있다. 특히 RNA, DNA, Protein 각각의 분석 결과를 통합하거나, single cell에서 동시에 다른 샘플을 분석하여 multi-omics한 결과를 얻고, cell 단위의 분석을 spatial tissue로 확장시키는 것까지 다루고 있다.
-> [Review] Lee, Jeongwoo, and Daehee Hwang. "Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods." Experimental & Molecular Medicine 52.9 (2020): 1428-1442.
Single cell mono-omics 분석보다 multi-omics 분석을 진행했을 때 더 의미 있는 데이터를 얻을 수 있음을 안내하며, 이를 위한 cell isolation, sequencing, 데이터 분석 과정에 대해 다루고 있다. Multi-omics 분석을 통해 single cell level에서의 세포 유형 과 기능을 구분할 수 있음을 강조하며,
PicoPLEX® 기술을 비롯한 scWGS,
SMART-seq®을 비롯한 scRNA-seq 기술 등을 응용한 분석 과정을 확인할 수 있다.
-> [Review] Wu, Yan, and Kun Zhang. "Tools for the analysis of high-dimensional single-cell RNA sequencing data." Nature Reviews Nephrology 16.7 (2020): 408-421.
Single cell RNA-seq 데이터의 준비부터 분석까지, 각 과정에서 활용되고 있는 다양한 최신 분석 기법의 broad overview을 제시하고 있다. 특히 data 분석 시의 UMI의 중요성과 이를 분석하는 툴과 활용성을 확인할 수 있다.
-> [Review] Louie, Raymond HY, and Fabio Luciani. "Recent advances in single-cell multimodal analysis to study immune cells." Immunology and Cell Biology 99.2 (2021): 157-167.
Single cell multi-omics 분석 기법이 발달하면서, 이를 single T/B cell에 적용하면 full length의 TCR/BCR 분석은 물론 immune cell lineage, cell fate, heterogeneity 등을 확인할 수 있음을 다양한 immune cell 연구 사례와 함께 안내하고 있다.
Single cell의 RNA-seq 제품과 최신 참고 문헌
** 각 논문 내용은 요약되어 기술되어 있으며, 상세한 내용은 링크되어 있는 논문 원문을 확인해 주세요.
실험절차 |
추천 제품명 |
특징 |
Whole Transcriptome Amplification (WTA) |
SMART-Seq® Single Cell PLUS Kit |
- Single cell RNA-Seq 최적의 제품
- Single cell direct protocol only
- RNA 함량이 낮은 세포에도 적용 가능
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SMART-Seq® v4 PLUS Kit |
- Single cell, bulk cell을 모두 분석할 때 최적
- 편향성 없는 full length-WTA
- 수많은 Reference paper로 증명된 성능
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SMART-Seq® HT PLUS Kit |
- Automation을 이용한 high-throughput (HTP) 분석에 최적화된 프로토콜
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Stranded RNA-seq library prep |
SMART-Seq® Stranded Kit |
- Single cell direct 혹은 total RNA로부터 random primer를 이용한 library 제작
- Stranded origin 정보 확인
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-> Gonenc, Ipek Ilgin, et al. "Single-cell transcription profiles in Bloom syndrome patients link BLM deficiency with altered condensin complex expression signatures." bioRxiv (2021).
Bloom syndrome (BS)에서 보이는 gene expression 분석을 위해, Wild type 2종과 BS cell line 3종을
ICELL8® cx Single-Cell System으로 single cell isolation 하고,
SMART-Seq® Single Cell PLUS Kit을 이용해 NGS library를 제작하여 BS에서 특징적으로 보이는 분자적 특성을 확인하였다.
-> Shi, Fanghao, et al. "A Microfluidic Chip for Efficient Circulating Tumor Cells Enrichment, Screening, and Single-Cell RNA Sequencing." Proteomics 21.3-4 (2021): 2000060.
Circulating tumor cells (CTCs)에서 tumor heterogeneity, metastasis, drug resistance를 분석하였다. 그 과정에서 microfluidic chip에서 분리한 single CTC를
SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for Sequencing로 cDNA 합성하여 NGS로 유전자 발현을 확인하였다.
-> Bell, Oliver H., et al. "Single eye mRNA-Seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation." Frontiers in immunology 10 (2020): 3033.
급성 감염으로 인한 retinal microglia의 반응과 회복을 확인하기 위해,
SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for Sequencing를 이용해 FACS로 분리한 급성 감염 전후의 single retinal microglia의 transcriptional change를 분석하였다.
-> Takeuchi, Hiroki, et al. "Single cell profiling of transcriptomic changes during in vitro maturation of human oocytes." (2021).
Human oocyte의
in vitro maturation을 확인하기 위해,
SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for Sequencing을 이용해 single oocyte의 RNA-seq을 진행하였으며, 이를 통해 발달 과정에서 보이는 transcripts을 분석하였다.
-> Hertzano, Ronna, et al. "Cell type-specific expression analysis of the inner ear: a technical report." The Laryngoscope 131 (2021): S1-S16.
기존의 FACS, RNA/ribosomal pulldown 방식과 새로운 scRNA-seq 기법을 이용해, cell type 별 inner ear에 대한 specific expression을 확인하였다. 이 과정에서 library 제작 방식에 따른 결과 차이를 최소화하기 위해,
SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for Sequencing와 Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2를 이용해 transcripts를 분석하였다.
Single cell의 DNA-seq 제품과 최신 참고 문헌
** 각 논문 내용은 요약되어 기술되어 있으며, 상세한 내용은 링크되어 있는 논문 원문을 확인해 주세요.
-> Ito, Noriko, et al. "Isolation and characterization of fetal nucleated red blood cells from maternal blood as a target for single cell sequencing - based non - invasive genetic testing." Reproductive Medicine and Biology (2021).
전 세계적으로 non-invasive prenatal testing (NIPT)에 사용되는 샘플인 maternal plasma 내 fetal DNA가 적어 위양성이 발생할 수 있기에, 본 논문의 저자는 maternal blood에서 fetal nucleated red blood cells (fNRBCs) 만을 분리하여 NIPT 분석하는 workflow를 개발하였다. 이 workflow는 FACS로 fNRBC를 분리한 다음,
PicoPLEX® Gold Single Cell DNA-seq Kit로 library를 제작하여 NGS 분석하는 과정으로 진행된다.
-> Wang, Peng - Xiang, et al. "Detection of circulating tumour cells enables early recurrence prediction in hepatocellular carcinoma patients undergoing liver transplantation." Liver International 41.3 (2021): 562-573.
간암 환자 193명을 대상으로, 간 이식 전후의 CTC를
PicoPLEX® Gold Single Cell DNA-seq Kit를 이용해 NGS 분석하였다. 이를 통해 CTC가 간 이식 후의 간암 재발을 예측할 수 있는 biomarker로서 활용 가능함을 확인하였다.
-> Nakamura, Ikuko Takeda, et al. "Development of an optimal protocol for molecular profiling of tumor cells in pleural effusions at single - cell level." Cancer Science 112.5 (2021): 2006.
흉수 (pleural effusion) 내 floating tumor cell을 single cell level에서 WGA (Whole Genome Amplification) 분석을 통해 체세포 변이를 확인하는 protocol을 개발하였다. Single cell에서의 DNA 분석을 위해,
PicoPLEX® WGA Kit 로 WGA한 후 이를 NGS library로 제작하여 분석을 진행하였다.
Single cell isolation을 위한 시스템
