cfDNA 분석을 위한 plasma sample preparation

◆ Introduction
조직 생검을 이용한 분자학적 분석은 암을 통찰력 있게 연구할 수 있는 방법이지만, 분석하고자 하는 조직의 종류에 따라 샘플을 얻는 것이 힘들고, 침습적으로 샘플을 채취하는 과정에서 검사 대상이 불편하거나 위험할 수 있다는 한계를 가진다. 궁극적으로는 이런 한계로 인해 얻게 되는 샘플 수가 제한적이게 된다. 게다가, 암세포가 지속적으로 돌연변이를 유발하고 진화한다는 점을 감안할 때, 한 개인이 가지는 암세포는 heterogeneous한 유전 정보를 가지는 경우가 많다. 결과적으로, 조직 생검은 암세포 중 일부에 대한 유전 정보만 나타낼 수 있어, 전체적인 돌연변이 정보를 분석하기에는 충분치 못할 수 있다. 또한, 조직 생검은 채취된 시점에서의 양상만을 확인할 수 있기에, 시간 경과에 따라 암의 진행 또는 치료 반응 등을 확인하기 위해 후속적으로 생검이 필요하다는 것도 고려해야 한다. 이는 초기 암의 발달 단계를 연구하고자 하거나, 암 검출과 모니터링을 위한 바이오 마커를 연구하고자 할 때 한계로 작용할 수 있다.
최근에는 혈액 내에 존재하는 cfDNA나 miRNA와 같은 circulating nucleic acid을 이용한 액체 생검을 분석함으로써, 조직 생검의 한계와 침습을 최소화 하는 방식이 각광받고 있다 (Larrea et al. 2016; Neumann et al. 2018). Digital PCR과 NGS 기술의 진보로 샘플 내 아주 적은 양의 DNA를 포함하고 있더라도 높은 민감도와 특이성으로 이를 검출할 수 있게 되면서, 액체 생검을 이용한 분석 방식의 활용이 용이해졌다. 액체 생검을 위해서는 EDTA나 cell-free DNA BCT (i.e., “Streck”)와 같은 항응고제가 처리된 혈액을 채취해 층을 분리하고, 혈장 상층액에서 circulating nucleic acid만을 정제하여 사용하게 된다.
Circulating nucleic acid는 혈액 내 낮은 농도로 존재하고 있기에, 분석에 적합한 정도의 양을 얻으려면 상당한 양의 혈액이 요구된다. 다카라바이오는 적은 양의 cfDNA도 분석할 수 있도록 ThruPLEX® DNA-Seq Kit를 지원하고 있으며, 이를 이용하면 50 pg 수준의 DNA도 NGS 분석을 위한 library로 제작할 수 있다.

◆ Required material for plasma preparation
- 실험용 글로브, 소독제, 면봉, 토니켓 (지혈대)
- BD Vacutainer Venous Blood Collection Tubes with K2 EDTA, 10 mL (Becton Dickinson, Cat. No. 366643)
- 원심분리용 15 ㎖, 50 ㎖ 튜브
- 1,500g로 작동 가능한 원심분리기
- -70°C 혹은 그 이하의 freezer (혹은 드라이아이스 보관용기)

◆ Protocol of plasma preparation
[ Blood draw ]
1. K₂ EDTA를 포함하는 Vacutainer에 먼저 정보를 기재하고, 혈액을 채취한다.
2. Vacutainer 제품 설명서에서 안내하는 것과 같이 collection tube 내 충분히 채혈되었는지 확인한다. 권장하는 양보다 적은 양의 혈액은 권장하지 않는다. 이 외의 채혈 과정은 Vacutainer의 제품 설명서에 따른다.
3. 채혈이 완료된 즉시, 약 10회 정도 너무 세지 않게 튜브를 위아래로 뒤집는다. (다른 튜브를 채혈하는 중에 위아래로 뒤집어도 괜찮다.)
4. 원심분리 전 30분간 상온에서 채혈 튜브를 보관한다. 원심분리기가 낮은 온도에서의 작동되는 경우, 시간을 단축할 수 있다.

    NOTE: 검체는 채혈 후 4시간 이내에 모두 처리하여 동결 보존한다.

[ First centrifugation ]
1. 온도 설정이 가능하다면, 원심분리기를 4°C로 설정한다.
2. Collection tube 내 혈액을 1,500g에서 12분 간 원심분리한다.
3. 원심분리기에서 튜브를 꺼내 용혈 (bright red plasma)이 일어난 샘플은 폐기하고, 용혈이 일어나지 않은 튜브를 이용해서 다음 단계를 진행한다.
4. 원심분리 후에는 적혈구 위에 소량으로 존재하는 buffy coat (하얀색의 세포층)를 확인할 수 있다 (그림 1). Buffy coat가 흩어지지 않도록 주의한다.
5. 일회용 bulb pipette를 이용해, 각 collection tube에서 혈장을 원심분리용 15 ㎖ 튜브로 옮긴다.

• 혈장을 채취할 때 Buffy coat에 존재하는 세포를 최소화하기 위해서는 Vacutainer tube를 똑바로 세워 잡은 뒤, 피펫을 기울여 혈장을 빨아들이면서 천천히 아래로 이동한다.
• 혈장 내 세포 오염을 방지하기 위해, 항상 buffy coat 5 ㎜ 위나 혈장 1/4 정도까지만 샘플을 채취한다. 만일 혈장과 함께 세포가 채취된 경우에는 이미 채취한 샘플에 첨가하지 않고 즉시 폐기한다.

    NOTE: 원심분리는 그림 1과 같이 적혈구와 백혈구로부터 혈장을 분리시킨다. 가장 중요한 과정은 원심분리 후 피펫팅을 하는 과정에서 buffy coat를 제외하고 혈장만 얻는 것으로, 충분한 여유 볼륨을 남겨 두고 샘플을 채취한다. 여유 볼륨을 줄이면 buffy coat의 혼입으로 plasma quality도 낮아질 수 있다.


그림 1. First centrifugation 이후 혈장을 채취하는 과정
Take care not to disturb the buffy coat when pipetting.

[ Second centrifugation ]
1. 원심분리용 15 ㎖ 튜브 내 혈장을 1,500g에서 12분 간 원심분리한다.
2. 새 일회용 bulb pipette를 이용해, 혈장 샘플을 원심분리용 15 ㎖ 혹은 50 ㎖ 튜브로 옮긴다.
3. 세포 pellet으로 인한 오염을 막기 위해, 원심분리용 튜브 바닥에 어느 정도의 잔량 (0.5 ㎖ 이상; 12 ㎜ 혹은 1/2” 정도 높이)의 혈장을 남긴다.
4. 조심스럽게 pooling tube를 흔들어 혈장을 섞어주고, 총 plasma 용액 량을 측정한다.
5. 혈장이 담긴 pooling tube를 똑바로 세워, -70°C 혹은 -80°C에 보관하거나, 4시간 내 사용하는 경우 dry ice에 파묻는다. 단기간 보관이 필요하다면 -20°C에서 overnight 보관이 가능하다.
6. 사용하기 전까지 샘플을 -70°C 혹은 -80°C에서 보관한다.
7. 사용된 모든 튜브와 피펫은 생물학적 유해 폐기물 (biohazard waste)로 버린다.


그림 2. Second centrifugation 이후 혈장을 채취하는 과정
Leave a residual amount of plasma to avoid contamination with cells.