PicoPLEX® DNA-Seq, WGA kit 적용 논문
https://doi.org/10.1002/smtd.202100938
Isolation and Genomic Analysis of Single Circulating Tumor Cell Using Human Telomerase Reverse Transcriptase and Desmoglein-2
Jae Won Song, Jungyo Suh, Seok Won Lee, Jung Ki Yoo, Uijeong Lee, Jang Hee Han, Cheol Kwak, Minyong Kang, Yi Rang Kim, Chang Wook Jeong, Jin Woo Choi
아래 내용은 다카라코리아에서 직접 번역한 내용으로, 해석하는 과정에서 원작자의 의도와 상이한 내용이 포함되어 있을 수 있습니다. 학술 정보를 목적으로 하는 경우 원문을 참고하여 주시기를 바랍니다.
ㄴ Abstract 미리보기
순환계의 상피세포는 tumor로부터 기원하는 것으로 알려져 있기 때문에, epithelial cell adhesion molecule은 circulating tumor cell (CTC) 분리를 위한 표준 마커로 사용되어져 왔다. 그러나, 대부분의 암세포는 혈관 내로 침투하는
과정에서 epithelial-mesenchymal transition (EMT)를 거치게 되면서 사라지는 것으로 보인다. 따라서, CTC의 임상적 중요성을 더 심층적으로 이해하기 위해서는 CTC를 검출할 수 있는 보다 진보한 기술이 필요하게 되었다. 형광 monitor gene을
발현하는 바이러스를 암세포에 특이적으로 감염, 복제시키는 것은 CTC를 효과적으로 검출하는 방법으로 활용될 수 있다. 본 논문의 저자들은 대부분의 암세포에서 발현하는 것으로 알려진 desmoglein-2에 결합하는 adenovirus를 설계했으며,
암세포에 특이적인 human telomerase reverse transcriptase promoter를 활용해 viral E1 region을 조절하기 위해 삽입하였다. 이 adenovirus는 수술 전/후의 renal cell carcinoma (RCC)와 prostate cancer (PC) 환자의 CTC 수를 비교하는 데 활용하였다.
분리한 2~3개의 CTC는 whole genome sequencing (WGS)에 적합하였으며, 게놈 분석을 통해 primary tumor와 CTC 사이의 변이 차이를 증명하였다. 이를 종합해보면, 본 논문에서 제시하는 방법은 빠르고 재현성 있게 CTC를 분리할 수 있으며,
enriched genome sequencing을 통해 암 환자의 현장 진료 시스템 및 예후를 결정하는 데 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
재조합 adenovirus serotype 5/3의 작용 기전 |
GFP (+) single cell isolation 및 WGS library 제작 과정 |
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ㄴ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
PicoPLEX® Gold Single Cell DNA-seq Kit (Code R300669)
- Whole Genome Amplification (WGA)의 golden standard인 PicoPLEX® 기술 도입
- Single cell ~ 최대 5개 세포에서 심층적으로 전장 유전체 분석하는 경우에 적합
- WGA와 동시에 Illumina® 분석용 DNA-seq library를 제작하므로 시간 및 비용 절약
- Library 총 제작 시간 3시간 이내, hands on time 30분
- CNV, SNV, aneuploidy (염색체 이수성)을 매우 높은 민감도와 재현성으로 정확하게 분석 가능.
https://doi.org/10.1038/s41436-021-01145-6
Expanded clinical validation of Haploseek for comprehensive preimplantation genetic testing
David A. Zeevi, Daniel Backenroth, Elinor Hakam-Spector, Paul Renbaum, Tzvia Mann, Fouad Zahdeh, Reeval Segel, Sharon Zeligson, Talia Eldar-Geva, Ido Ben-Ami, Adi Ben-Yehuda, Shai Carmi & Gheona Altarescu
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ㄴ Abstract 미리보기
본 논문의 저자들은 이전에 착상 전 유전자 검사 (Preimplantation genetic testing, PGT)를 위한 Haploseek 분석법을 개발하였으나, 몇몇 주요한 기능이 누락되었으며 체계적으로 검증되지 못하였다.
따라서, 이 방식을 보다 확장하여, 배아의 조부모 DNA를 함께 분석하여, X 염색체 혹은 부모가 동일한 haplotype을 가지는 부위에서의 변이를 분석할 수 있도록 하였다. 모든 검체는 0.2X의 낮은 coverage를 이용해 시퀀싱하였으며,
SNP (single-nucleotide polymorphism) microarray genotyping을 수행하여 부모와 조부모 혹은 형제와 비교하였다. 이렇게 확장된 Haploseek 방식을 이용하여, 본 논문에서는 각 배아에서 보이는 염색체 내 copy-number variants (CNVs) 뿐 아니라
관련 variant-flanking haplotype을 예측해냈다. 각각의 임상 샘플은 PCR을 기반으로 한 PGT 방식을 통해 예측한 haplotype을 검증하였고, CNV 예측은 기존에 상용화된 kit와 비교하여 검증하였다. 총 151개의 배아 생검에서 모두 Haploseek 를
통해 확인한 haplotype과 CNV가 임상 PGT 결과와 일치하였으며, 17개의 상염색체 우성, 5개의 상염색체 열성, 3개의 X 염색체 관련 단일 유전자 질환을 포함하였다. 또한 1개의 로버트슨 전좌 염색체 이상과 2개의 상호전위,
17개의 염색체 copy-number counting이 수행되었다. 이 결과는 Haploseek 방식이 임상적으로 정확성이 있으며, 임상 PGT 분석에서 사용되는 모든 적용성에 부합함을 증명한다.
ㄴ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
Single cell/blastomere/blastocyst DNA는 다카라바이오의
PicoPLEX® WGA Kit 제품을 이용해 WGA 되었다.
이후 증폭된 각 세포의 DNA는 Illumina
®사의 Nextera XT library prep kit를 이용해 genome sequencing library로 제작되었다. 각 library는 normalization 및 pooling 과정을 거쳐, NextSeq 500 기기에서 1 X 75 single read 혹은 2 X 75 paired end를
이용해 0.2 - 0.4x의 coverage로 분석되었다.
ㄴ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
PicoPLEX® WGA Kit (Code R30050)
- PGS/PGD의 golden standard로 여겨지는 PicoPLEX® 기술 도입
- 1 ~ 10 human cells 혹은 15 ~ 50 pg of human DNA의 샘플에 적용 가능
- Single tube 내 3-step으로 완료되는 매우 간편한 프로토콜 - 샘플 오염 및 손실 최소화 과정
- DNA-seq library 제작, qPCR, array 등으로 최종 산물 분석 가능
[최신 버전]
PicoPLEX® Single Cell WGA Kit v3 (Code R300718)
- High-fidelity 효소 도입으로, CNV는 물론 기존에는 분석이 어려웠던 SNV까지 검출 가능
- Single tube, 3-step의 프로토콜이 2.5시간 내 완료됨
- 1 ~ 10개의 세포 혹은 15 ~ 60 pg DNA로부터 2 ㎍ 수준의 최종 산물로 증폭
