많은 연구자들은 항상 새로운 연구를 진행하고자 하지만 때때로 기존의 방법으로는 이를 따라가지 못하는 경우가 있다. 그렇기에 기존에는 불가능했던 새로운 분야의 연구를 진행하기 위해서는 새로운 기술을 개발하기 위한 도구가 매우 중요하다.

ICELL8 Single-Cell System은 개방성과 유연성을 고려하여 디자인되어 현재 많은 연구자들이 이러한 특징을 잘 활용하고 있다. 예를 들어 Henikoff's laboratory의 Dr. Steven (Fred Hutchinson Cancer Research)은 이러한 플랫폼을 활용해 chromatin mapping을 고 해상도로 single cell 단계까지 적용 가능한 CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) 이라는 epigenetics 연구를 위한 새로운 기술을 개발했다 (Kaya-Okur et al. 2019).

■ Going beyond ChIP-seq
Epigenetics는 같은 유전형에서 DNA의 구조, histone modification, DNA 메틸화가 어떻게 유전자의 발현과 표현형의 변화에 큰 영향을 미치는지를 이해하는데 초점이 맞춰져 있다 (Deichmann 2016). ChIP-seq은 이러한 epigenetics에서 매우 유용한 분석방법이지만 분석 과정에서 대량의 샘플이 필요하고 signal 대비 높은 noise의 비율로 인해 데이터 해석 과정이 매우 복잡하다는 한계가 있다.

실험법을 개발하는데 있어 낮은 background는 소량의 cell을 분석하는데 있어 중요한 요인이다. 2017년 Skene와 Henikoff는 CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease; Skene and Henikoff 2017)이라 부르는 enzyme-tethering 기술을 사용해 이를 해결했다. 이 기술은 ChIP methods에서 crosslinking을 이용하는 방법 대신 protein A-monococcal nuclease (protein A-MNase) fusion을 사용해 in situ에서 antibody가 결합한 transcription-factor-DNA (TF-DNA) complexes 양쪽의 DNA를 특이적으로 절단한다.

■ Getting to the single-cell level
기존의 CUT&RUN 방법도 실험의 자동화가 가능하고 소량의 샘플 (세포 100~1,000개)에서도 적용이 가능하지만, Henikoff의 연구실은 이를 더욱 개선할 방법을 연구했다. 특히 그들은 회수된 TF-DNA complex로부터 sequencing library를 만드는 과정에서 DNA end polishing과 adapter ligation을 생략하고자 했다. 이를 위해 protein A-Mnase fusion 대신 과활성 Tn5 transposase (pA-Tn5)에 융합된 protein A를 사용했다. 이 pA-Tn5가 활성화되면 사전에 들어간 sequencing adapter를 TF-DNA complexes 양쪽에 삽입하여 PCR-enrichment-ready fragment를 만든다. 이를 바탕으로 CUT&Tag 기술이 개발되었다. bulk ChIP-seq과 비교해서 이러한 방법은 분석의 signal 범위를 20배 높여준다.


CUT&Tag 법의 개요와 ICELL8 Single-Cell System에서의 workflow. (패널 A)
CUT&Tag의 프로세스를 나타내는 요약도이다. 타겟 단백질 (파란색)에 primary antibody (연두색)가 결합하면 여기에 secondary antibody (노란색)가 결합하게 된다. 이후 adapter (빨간색)가 추가된 Tn5 transposase에 융합된 protein A (회색)가 secondary antibody에 결합하고 adapter를 target site에 추가한다. 이후 fragment가 PCR에 의해 증폭된다. (패널 B) single cell에서의 CUT&Tag을 ICELL8 Single-Cell System에서 적용한 경우의 workflow이다. (Figure by Kaya-Okur et al. 2019, used under CC-BY-NC-ND 4.0).

저자들은 CUT&Tag 기술의 감도로 single-cell profiling (scCUT&Tag) 역시 가능할 것이라고 예상하고 있다. 이 기술은 cell의 permeabilization을 필요로 하는데 이 과정에서 세포가 극도로 민감해지기 때문에 single cell을 최대한 자극없이 분리하는 과정이 필요하다. Takara의 automated ICELL8 플랫폼이 tagmentation후 이러한 permeabilized cells을 5,184-well chip으로 분주하는데 사용되었고, 여기에 통합 이미징 기능을 통해 well을 확인해 single cell 만을 포함한 well을 선별하여 커스텀화 된 시약 설정으로 PCR했다. 마지막으로 연구원들은 ICELL8에 있는 특정 시약 분주 시스템을 통해 각 cell이 고유한 index의 조합을 받는 방식으로 72 i5 및 72 i7 index를 부가해 해당 데이터를 특정 cell로 다시 추적했다. 이러한 과정에서 저자는 scCUT&Tag으로 얻은 데이터가 bulk에서의 chromatin profiling과 잘 일치한다는 것을 확인했다 (Figure 6 in publication).

■ Sequence better, faster, and deeper
우리의 ICELL8 system은 분석법 개발 및 최적화를 위해 유연하고 적응성 높은 플랫폼을 제공한다. 이 기사에서는 어떻게 Dr. Henikoff의 연구실에서 우리의 플랫폼을 새로운 scCUT&Tag 기술을 개발하는데 사용했는지를 보여준다. 이외에도 다양한 연구자들이 이러한 플랫폼을 활용하고 있고 이를 활용하여 single cell sequencing을 수행하고 자동화했다.

■ Reference
Deichmann, U. Epigenetics: The origins and evolution of a fashionable topic. Dev. Biol. 416, 249-254 (2016).

Kaya-Okur, H. S. et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. bioRxiv 568915 (2019).

Skene, P. J. & Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife 6, (2017).

■ 원문
Bringing epigenomic profiling to the single-cell biology stage (takarabio.com)