4세대 Lenti-X™ Expression System Overview
4세대 Lentivirus packaging 시스템인
Lenti-X™ Expression System (Code 632164 외)은 높은 수율, 편리한 사용, 안전성을 위해 시스템을 최적화되었다. 이 제품은 타겟하는 tropism에 따라 다양한 pseudotype (envelope 단백질)을 선택할 수 있도록 아래와 같이 준비되어 있다.
- VSVG envelope - VSVG pseudotype의 lentivirus는 사실상 대부분의 cell type에 감염이 가능하다. 또한 실험 목적에 따라 integration이 일어나지 않는 Integrase Deficient 제품도 선택이 가능하다.
- Ecotropic envelope - MLV ecotropic envelope glycoprotein을 가지는 pseudotype lentivirus는 mouse와 rat에만 transduction이 가능하다.
- Envelope Free - 원하는 envelope 유전자를 empty vector에 직접 cloning하여 해당 envelope을 가진 pseudotype lentivirus를 생산할 수 있다. 이는 감염병 연구에서 중화실험 (neutralization assay) 목적으로도 사용이 가능하다.
4세대 Lentivirus packaging 시스템에 대한 내용은 아래의 동영상에서 확인할 수 있다.
■ 특징 1. 고역가의 Lentivirus 생산
당사의
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외) 을 사용하는 4세대 lentivirus packaging 시스템은 시중에 판매되는 다른 lentivirus 시스템에 비해 월등히 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다 (10
7~10
8 IFU/㎖, 시중에 판매되는 일반적인 제품의 25배 이상).
How are such high titers achieved?
- 최적화된 조성 - 4세대 lentivirus 시스템에 다섯가지 packaging plasmid (그림 1)와 transfection 시약의 비율이 생산 효율을 극대화할 수 있도록 최적화된 premix 형태로 제공된다.
- Tetracycline transactivation - 4세대 lentivirus 시스템은 Tet-system promoter를 사용해 packaging plasmid의 유전자를 높게 발현한다.
- 최적화된 transfection 시약 - premix에 포함된 Xfect™ transfection Reagent는 HEK 293T cell에서 일관되게 95% 이상의 효율을 보여 packaging plasmid의 유전자를 높게 발현한다.
- 최적화된 Lenti-X™ 293T cell line - 본 시스템과 함께 사용할 경우 가장 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하도록 선별된 packaging cell로 108 IFU/㎖의 lentivirus를 생산할 수 있다.
그림 1. 4세대 lentivirus 시스템에 5가지 packaging plasmid (오른쪽). 4 세대 lentivirus 시스템은 Tet-Off와 Tat transactivator에 의해 바이러스를 구성하는 필수적인 단백질을 높게 발현한다. 여기서
pol 유전자가
vpr 유전자와 융합되어 reverse transcriptase와 integrase가 바이러스 안에 같이 packaging되게 한다. 또한 이 시스템은
gag 및
pol 유전자를 다른 plasmid로 분리해서 안전성을 향상시켰다.
How much packaged lentivirus can be obtained from a single Lenti-X packaging reaction?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)을 사용하면 10
7~10
8 IFU/㎖으로 시중에 다른 lentivirus 시스템의 역가를 월등히 뛰어넘는 고역가로 lentivirus 상등액 10 ㎖을 생산할 수 있다 (그림 2).
그림 2. Lenti-X™ 시리즈 (패널 A)와 타사 packaging 시스템 (패널 B)을 사용해 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)에서 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus를 생산. 생산된 lentivirus
배양 상등액을 HeLa cell에 transduction하였다. 그 결과 Lenti-X
™ 시리즈로 생산된 상등액 10 ㎕은 대부분 cell 내로 도입되었고, 다른 제품으로 생산된 상등액 10 ㎕은 극히 일부의 cell 내로만 도입되었다.
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)의 최대 역가는 pLVX backbone에서 ZsGreen1을 발현해 flow cytometry로 측정한 결과 5 x 10
8 IFU/㎖ (농축하지 않은 경우)이었다. pLVX 벡터는 cPPT/CTS, RRE, WPRE, wild-type 5' LTR 서열을 가지고 있어 고역가 lentivirus 생산이 가능하다. 13번의 실험에 걸쳐 10종의 형광 단백질을 사용해 테스트한 결과 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)과 pLVX 벡터를 사용한 경우, 평균 1.85 x 10
8 IFU/㎖ 역가를 생산할 수 있었다 (HeLa cell에 transduction 하여 flow cytometry로 측정한 결과).
■ 특징 2. 안전성 강화
Lentivirus 시스템은 안전성을 위해 복제 능력을 가진 바이러스 (replication-competent lentivirus; RCL)가 최대한 발생하지 않도록 기술이 개발되었다. RCL은 packaging plasmid의 유전자 (
gag-pro,
env,
pol 등)가 recombination을 통해 expression vector에 삽입되는 경우 생성된다. 4세대 lentivirus 시스템은
gag-pro 유전자와
pol 유전자가 별도의 두 개의 plasmid에 있기 때문에 (그림 1) 세 번의 recombination이 발생해야 RCL이 생성될 수 있다. 따라서 4세대 lentivirus는 plasmid의 recombination으로 인한 RCL이 발생할 가능성이 낮기 때문에 더욱 안전성이 높다.
■ Lentivirus packaging FAQ
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275)을 사용하면 매우 간단한 프로토콜로 고역가의 VSV-G의 pseudotype lentivirus 생산이 가능하다. 이 제품의 tube에는 Xfect™ transfection Reagent와 packaging plasmid가 최적의 조성으로 premix되어 동결건조 형태로 제공되어 lentivirus expression vector와 물만 넣어서 10 cm dish의 293T cell에 넣어주면 고역가 lentivirus를 간단하게 생산할 수 있다.
그림 3. Lenti-X™ Packaging Single Shots workflow
당사는 VSV-G pseudotype lentivirus 이외에도 ecotropic pseudotype lentivirus를 생산하기 위한 packaging 시스템을 판매하고 있다.
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)의 간단한 실험을 아래의 동영상에서 확인하실 수 있습니다.
What type of cells should be used for packaging?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은
Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)와 같이 사용하기에 최적화되어 있다. 이 cell은 Takara에서 높은 역가의 lentivirus를 생산할 수 있도록 선별된 clone이다. HEK293이나 293FT 같은 cell도 사용할 수 있으나 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180) 대비 더 낮은 역가의 lentivirus가 생산될 수 있다.
그림 4. Lenti-X™ 293T Cell Line을 사용한 경우 293FT 대비 6배, HEK293 대비 30배 이상의 고역가로 lentivirus를 생산할 수 있다.
How consistent are results?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 실험 과정에서 생길 수 있는 변수를 최소화하여 일관된 transfection 효율로 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다.
그림 5. 일관된 고효율 transfection으로 고역가 lentivirus 생산이 가능하다.
ZsGreen 1을 발현시키는 lentivirus를
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)으로 네 번에 걸쳐 생산하였다. Transfection 후 48시간이 지난 다음 packaging cell을 형광현미경과 일반 현미경으로 관찰하였고 (
패널 A), 이후 lentivirus가 있는 상등액을 회수해서 HT1080 cell에 transduction하여 역가를 측정하였다 (
패널 B).
Which types of lentiviral vectors are compatible with this system?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 expression vector의 backbone이나 사용된 titration 방법의 종류와 관계없이 높은 역가의 바이러스를 생산할 수 있다.
그림 6. Expression vector의 backbone에 관계없이 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다.
CMV ZsGreen1 유전자를 각각의 expression vector에 cloning하고 이 vector를 Lenti-X™ Packaging Single Shots으로 packaging하여 lentivirus를 생산하였다. Transfection 후 48시간 뒤 역가를 다양한 방법으로 측정하였고 (qRT-PCR, Lenti-X qRT-PCR Titration Kit / p24 ELISA, Lenti-X p24 Rapid Titer Kit / 간이 역가측정, Lenti-X™ GoStix™), 실제 감염성을 테스트하기 위해 바이러스 상등액을 HT1080 cell에 transduction 후 flow cytometry로 측정하였다.
이론적으로 HIV-1 기반의 lentivirus expression vector는
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)으로 매우 효과적이게 packaging 될 수 있다. 예를들어 ZsGreen1을 pLenti6/V5 vector (Thermo Fisher Scientific)에 cloning한 경우 이 vector는 WPRE 와 cPPT/CTS 서열이 없이ㄸ self-inactivating (SIN) LTR을 사용해 약 3 x 10
7 IFU/ml 정도의 역가가 나온다 (flow cytometry 측정 결과). 반면, Lenti-X™ 시스템은 HIV-1 유래의 5’LTR에 있는 tat transactivation과 WPRE 와 cPPT/CTS 서열을 사용해 다른 방법보다 더욱 높은 역가의 lentivirus를 생산할 수 있다 (예, pLVX vector 시리즈).
What is the cloning/packaging capacity of an HIV-1-based lentiviral vector?
Wild type lentivirus는 양끝 LTR 서열 사이로 ~9.7kb의 genome을 가지고 있다. 인공적으로 만든 lentivirus가 이보다 큰 genome을 가지는 경우 바이러스가 불안정해지고 역가 역시 급격하게 감소한다. Lenti-X™ 시스템과 같은 제품으로 생산된 재조합 lentivirus는 바이러스 genome의 많은 부분이 selection marker나 형광 단백질과 같은 유용한 서열로 대체되었지만 transgene을 cloning하기에 충분한 공간이 남아있다.
- pLVX-Puro vector의 경우 3’ LTR까지 약 5.4 kb의 서열이 있다. 따라서 최대 약 4.3 kb의 서열을 transgene으로 cloning할 수 있다.
- pLVX-IRES-tdTomato의 경우 3’ LTR까지 약 6.3 kb의 서열이 있다. 따라서 최대 약 3.4 kb의 서열을 transgene으로 cloning할 수 있다.
■ 추천하는 Lentivirus packaging 시스템
