아래의 내용은 주로 당사의 4세대 Lentivirus 시스템 Lenti-X™ Expression System (Code 632164 외)을 사용한 경우에 대한 일반적인 내용입니다.

Q1. HIV-1 유래의 lentivirus에서 insert의 최대 size는 얼마인가요?
Wild type의 lentivirus는 양 말단의 LTR을 포함하여 약 9.6 kb의 genome을 가집니다. 인공적으로 구축된 genome이 wild type보다 크다면 viral particle이 불안정해져 viral titer가 급격하게 저하됩니다. Lenti-X™ Expression System (Code 632164 외)과 같은 재조합 lentivirus는 불필요한 viral genome을 제거하고 selection marker나, 형광단백질 유전자 등 유용한 서열로 대체되어 있으면서 목적유전자 (GOI) 삽입을 위한 충분한 용량(size capacity)을 확보하고 있습니다.
모든 pLVX vector는 각기 다른 기능을 가진 유전자를 포함하고 있기 때문에 삽입 가능한 유전자의 크기가 다릅니다. pLVX vector에 삽입 가능한 유전자 최대 크기는 각 제품의 vector map을 확인하여 계산 가능하며, wild type의 lentivirus genome 사이즈인 9.7 kb에서 벡터의 3’ LTR 위치를 뺀 값이 삽입 가능한 최대 유전자의 길이입니다 (5’ LTR은 벡터의 시작지점 입니다.).

<예시>

• pLVX-Puro vector (#632164 구성품) : Vector map에서 3’ LTR은 5.4 kb에 위치함으로 최대 4.3 kb의 목적유전자 (GOI)를 삽입할 수 있습니다 (9.7 kb - 5.4 kb = 4.3 kb).
• pLVX-IRES-tdTomato (Code 631238) : Vector map에서 3’ LTR은 6.3 kb에 위치함으로 최대 3.4 kb의 목적유전자 (GOI)를 삽입할 수 있습니다 (9.7 kb - 6.3 kb = 3.4 kb).

Q2. 당사의 Lenti-X™ 시리즈의 expression vector와 wild type의 HIV-1은 어느 정도의 유사성을 가지고 있나요?
약 25%의 유사성을 가지고 있습니다. 예를 들어, pLVX-Puro vector (#632164 구성품)는 wild-type의 HIV-1 genome (9,719 bp)과 비교하여 약 2,430 bp의 연속되는 유사 서열을 포함하고 있습니다.

Q3. Lentivirus에 insert를 cloning시 내 목적유전자 (GOI)에 internal poly(A) signal을 포함시켜야 하나요?
아니오. lentivirus의 expression vector는 3' LTR 부위에 전사종결인자가 존재하기 때문에 GOI 또는 selection marker의 gene expression cassette에는 poly(A) signal이나 그 어떠한 전사종결서열 (transcription termination signal)을 포함시켜서는 안됩니다. 만약, Lentiviral construct의 중간에 전사종결서열이 포함이 된다면 viral genomic DNA의 불완전한 전사를 초래할 수 있으며, 이는 바이러스의 패키징 효율이나 유전자 도입 효율 저하의 원인이 됩니다.

Q4.형광 단백질을 발현하는 IRES-lentiviral expression vector의 적정 insert size는 얼마인가요?
형광단백질을 발현하는 IRES-lentiviral expression vector의 경우 적절한 삽입 유전자의 크기는 0.7 ~ 1.2 kb이고 2.5 kb 이상은 권장하지 않습니다. 반면 항생제 내성 유전자를 발현하는 IRES-lentiviral expression vector의 경우2.5 kb 이상의 목적유전자 (GOI)를 삽입 가능합니다. 이는, 큰 사이즈의 GOI로 인해 항생제 내성유전자의 발현율이 낮아진다 하더라도 drug resistance 조건에서 충분히 생장할 수 있기 때문입니다.

Tip: GOI가 삽입되지 않은 “empty” IRES lentiviral expression vector에서는 형광단백질의 발현 효율이 낮아집니다, 만약 목적 유전자를 삽입하지 않는다면, 0.5~1.2 kb의 stuffer sequence를 IRES의 업스트림 위치에 삽입하여 사용하는 것을 추천합니다.

Q5. lentiviral expression vector를 일반 plasmid transfection 용도로 사용할 수 있나요?
사용할 수 있습니다. 하지만 Lentiviral 벡터를 일반 plasmid vector처럼 transfection 용도로 사용하는 경우 lentiviral transduction의 재현성 높은 목적 유전자 (GOI) 삽입이라는 (reproducible integration of individual copies of your transgene) 장점을 기대할 수는 없습니다. Lentiviral transduction의 경우 lentivirus로부터 생성된 proviral DNA가 5'-LTR, 3'-LTR을 이용하여 목적세포에 높은 정확한 copy number로 삽입되는 것에 반하여, plasmid transfection의 경우 무작위로 쪼개어져 숙주세포의 게놈에 무작위 삽입되기 때문입니다.

Q6. 어떤 종류의 lentiviral expression vector를 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)와 함께 사용할 수 있나요?
HIV-1 기반의 lentiviral vector는 대부분 다카라의 Lenti-X™ 시리즈의 패키징 시스템인 Lenti-X Packaging Single Shot (Code 631275 외)과 함께 사용할 수 있습니다.

Q7. Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)에는 어떤 종류의 293 cell line이 필요한가요?
Lenti-X™ Packaging Single Shot을 이용한 Lentiviral 패키징은 Lenti-X 293T Cell Line (Code 632180)과 293T cell에 최적화되었습니다. HEK 293 또는 293FT에 사용할 경우 바이러스 역가가 감소될 수 있습니다 (그림 1).

그림 1. Lenti-X 293T Cell Line을 사용한 경우 HEK 293 cell과 293FT cell 보다 각각 30배, 6배 많은 바이러스를 생산할 수 있었습니다.

Q8. Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 몇 번 packaging에 사용할 수 있나요?
Lenti-X™ Packaging Single Shot (Code 631275 외)은 하나의 튜브에 Lentiviral packaging plasmid와 Xfect Transfection reagent가 혼합되어 있어 한 개의 10cm tissue culture plate에 적용할 수 있습니다.

Q9. Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)으로 얼마나 많은 lentivirus를 생산할 수 있나요?
Lenti-X™ Packaging Single Shot (Code 631275 외)은 한번에 한 개의 10 cm tissue culture plate에 적용될 수 있으며 별도의 농축 없이 최대 10⁷~10⁸의 IFU/㎖의 lentivirus를 생산할 수 있습니다. 타 lentivirus 패키징 시스템과 비교했을 때 훨씬 많은 IFU/㎖의 lentivirus를 생산할 수 있었습니다 (그림 2)

그림 2. Lenti-X™ 293T cells을 사용하여 ZsGreen 1을 발현하는 lentivirus를 생산한 경우 (패널 A, 당사의 Lenti-X™ lentivirus 패키징 시스템을 사용 / 패널 B, 타 lentivirus 패키징 시스템을 사용).
HeLa cell에서 당사의 lentivirus 패키징 시스템으로 생산된 lentivirus 상등액의 경우 10 ㎕로 대부분의 cell에 transduction된 반면, 타 lentivirus 패키징 시스템으로 생산된 lentivirus 상등액은 10 ㎕로는 오직 일부분의 cell에만 transduction되었습니다.

Q10. Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 몇 세대의 lentivirus 인가요?
Lenti-X™ Expression System (Code 632164 외)은 gag와 pol 유전자를 별개의 packaging plasmid로 나눠둔 4세대 lentivirus 시스템입니다 (그림 3). 유전자를 별개의 plasmid로 나눔으로써 RCL (Replication-competent lentivirus)의 발생을 방지합니다.

그림 3. 당사의 Lenti-X™ packaging systems은 위와 같은 5개의 packaging plasmid가 최적화된 조성으로 mix되어있습니다.
이 시스템은 Tet-Off와 tat transactivator를 통해 필수적인 viral component의 유전자들을 높게 발현하고, 고역가의 바이러스를 생산하도록 합니다. 또한 pol 유전자가 vpr과 융합되어 있어 reverse transcriptase/integrase 단백질이 viral particle로 잘 들어가도록 합니다.

Q11. 왜 Tet System Approved FBS를 반드시 사용해야 하나요?
4세대 Lentiviral Packaging Single Shot 시스템은 바이러스의 필수 유전자의 고발현을 위하여 transactivation-cascade를 적용하였습니다. Tet-Off transactivator는 plasmid에 있는 TRE promoter로 gag-pro, tat-transactivator, rev 유전자를 발현시킵니다. 이렇게 발현된 tat transactivator는 다른 plasmid에 위치한 pol 단백질의 발현을 유도합니다. 따라서 배양 시 사용하는 Serum 내에 tetracycline 또는 그 유사물질이 포함되어있는 경우, Tet-off transactivator protein의 구조의 변이를 유도하여 TRE promoter와의 결합을 억제할 가능성이 있습니다. 그 결과, 바이러스 필수 유전자의 발현에 영향을 주어 viral titer가 저하됩니다. 4세대 버전의 Lentiviral packaging system은 당사에서 판매 중인 Tet-Free FBS에 최적화 되어있습니다 (그림 4).

그림 4. 당사의 Tet-free FBS는 tetracycline-inducible expression system에서 일관된 결과를 보이도록 기능적으로 테스트되고 있습니다.
기능적으로 테스트되지 않은 타 serum은 tetracycline-inducible expression system에 사용하는 경우 tetracycline이 포함되어 Tet-Off system (혹은 Tet-On system)에 maximum expression 혹은 background expression에 영향을 줄 수 있다.

Q12. Lenti-X™ Concentrator를 Retrovirus 농축에 사용할 수 있나요?
예. Lenti-X™ Concentrator (Code 631232 외)의 incubation time을 Retro-X™ Concentrator (Code 631456)처럼 늘리면 Retrovirus 농축에 사용할 수 있습니다. 이 링크에서 Lenti-X™ Concentrator (Code 631232 외)를 사용한 동영상을 확인하실 수 있습니다.

Q13. Lenti-X™ Gostix™ Plus를 lentivirus 역가 측정에 사용하는 장점이 무엇인가요?
Lenti-X™ Gostix™ Plus (Code 631280 외)를 사용하면 빠르고 간단한 방법으로 10분만에 lentivirus의 역가를 측정할 수 있습니다. qPCR이나 ELISA등을 사용하거나 functional titer를 측정하는 기존 방법은 실험 시간이 매우 길고 번거롭기에 바이러스 생산 시 바이러스를 회수할 타이밍을 결정하거나 다수의 샘플을 테스트하는 경우 적합하지 않습니다. Lenti-X™ Gostix™ Plus (Code 631280 외)를 사용하면 20 ㎕의 배양 상등액으로 10분만에 스마트폰 앱을 사용해 역가를 측정할 수 있으며 기록된 역가 측정 결과를 email로 발송하여 저장할 수도 있습니다.

그림 5. 대중적으로 사용되는 lentivirus titration 방법들과 소요시간 비교.
Lenti-X™ Gostix™ Plus : lateral flow-based method를 사용해 배양 상등액에 있는 lentivirus의 p24 단백질 정량
qRT-PCR : qRT-PCR을 통해 viral RNA genome을 정량
ELISA : 배양 상등액에 있는 lentivirus의 p24 단백질 정량
PCR : qPCR을 통해 숙주로 삽입된 (gDNA에) proviral DNA 정량
IFU (FACS) : FACS를 통해 RFP 또는 GFP positive cell을 정량
IFU (Selection) : 항생제 저항성을 가진 colony를 정량

Q14. MOI가 무엇인가요?
MOI (multiplicity of infection)는 바이러스를 접종시킨 세포수에 대한 접종 바이러스 양의 비율로써, 접종 바이러스양/세포수를 의미합니다. 즉, 세포 1개당 몇 개의 감염성 바이러스를 접종할 수 있는지에 대한 단위입니다.

Q15. IFU가 무엇인가요?
IFU (infectious units)는 바이러스로 타겟세포를 감염시켜 삽입된 유전자에서 단백질을 발현할 수 있는 능력을 뜻합니다. Infectious viral titer (IFU/㎖) 를 측정하기 위해 reporter를 검출하거나 세포에서 발현된 단백질을 flowcytometry나 immunostatining등으로 확인합니다.
최근에는 위 방법보다 신속하게 titer를 측정할 수 있는 제품들이 사용되고 있습니다.

• Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit (Code 631235)
• Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit (Single Wash) (Code 631476)
• Lenti-X™ GoStix™ Plus (Code 631280)

Q16. CFU가 무엇인가요?
CFU (colony forming unit)은 drug selection 과정에서 항생제 내성 유전자 (antibiotics resistance gene)를 가진 proviral DNA를 보유한 세포만이 생존할 수 있는 점을 이용하여 drug-resistance cell colony를 카운팅한 수치입니다.

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