• 빠르고 간편한 ELISA 기반의 역가측정 프로토콜
• 간단한 실험과정: 배양 상등액 회수, lysis, binding, detection
• p24 양에 따라 바이러스 역가 측정

■ Introduction

Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit는 HIV-1 유래의 lentivirus 배양 상등액에서 빠르게 역가를 측정할 수 있는 ELISA kit 이다. Microtiter plate (12 x 8-well strip)의 well은 테스트 샘플 내에 존재하는 p24 core/capsid protein과 정량적으로 결합하는 anti-p24 capture antibody가 코팅되어 있다. 특이적으로 결합된 p24는 biotinylated anti-p24, streptavidin-HRP conjugate, 발색 기질을 사용하여 일반적인 샌드위치 ELISA 형태로 검출된다. 이후 p24 표준곡선으로 p24 함량을 정량화하여 lentivirus 역가를 계산할 수 있도록 한다.


그림 1. Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit 프로토콜.
바이러스 producing cell 배양상등액에 존재하는 lentivirus의 p24는 anti-p24가 코팅된 well에 결합하고, 이후 biotinylated anti-p24 2차 항체, streptavidin-HRP, 발색 시약을 통해 검출된다.

■ Overview

What is p24?
연구용으로 생성된 재조합 lentivirus는 3세대 또는 4세대 (예: Lenti-X™ 키트로 생성)에 관계없이 VSV-G 또는 ecotropic envelope protein, matrix protein, virus core protein를 포함한 주요 구조 단백질을 포함한다 (그림 2).
여기에서 gag 유전자는 viral capsid protein (p24), nucleocapsid protein (p6와 p7), matrix protein (p17)을 코딩한다. Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit는 이중 특히 바이러스 상등액에 존재하는 p24 capsid protein의 양을 측정하며 p24의 양이 곧 바이러스 역가를 대변한다.


그림 2. p24는 lentivirus capsid에 위치하며 HIV-1 gag 유전자에 의해 암호화된 네 개의 단백질 중 하나이다.

How does it work?
먼저 제품 내에 포함된 buffer로 Lentivirus 상등액의 바이러스를 용해시키고 p24를 방출시킨 다음, 각 well에 murine anti-p24 antibody가 코팅되어 있는 96-well microtitration plate (12 x 8-well strips)에 분주하였다. 결합되지 않은 lysate 등을 제거/세척한 후 biotinylated anti-p24 secondary antibody, streptavidin-HRP (horseradish peroxidase), 발색 시약을 사용하여 특이적으로 결합한 p24의 양을 검출한다.
이 키트에는 표준 곡선을 작성하고 상등액의 역가를 계산하는 데에 필요한 p24를 측정하기 위한 p24 control이포함되어 있다.

■ Result

Calculating your titer
상등액의 역가는 p24값을 바이러스 함량 또는 감염성과 연관시켜 결정한다 (그림 3). 둘 간의 상관계수가 정리되면 사용 중인 바이러스 생산 시스템에서 p24 값과 감염성 간의 상관관계를 정의할 수 있고, 제품 매뉴얼에 안내된 바와 같이 p24 값을 기반으로 한 바이러스의 역가를 계산할 수 있다.

Lentivirus 기술의 선두 주자로서 당사는 고역가의 lentivirus를 사용하여 모든 세포 유형에 cDNA 또는 shRNA를효과적으로 전달하기 위한 광범위한 Lenti-X™ expression system 및 기타 소모품을 제공한다.


그림 3. p24값과 lentivirus 역가 간의 상관관계
pLVX-ZsGreen1 vector를 사용하여 생성된 Lenti-X™ 상등액을 Lenti-X™ p24 Titration Kit를 사용하여 p24 양을 분석하였다. HT1080 세포를 지시된 양의 p24를 함유하는 상등액 희석액으로 감염시키고 48시간 뒤, 형질도입된 세포의 수를 flow cytometry로 카운팅하여, 평균 형광강도를 측정하였다.

■ Conclusions

Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit는 빠르고 심플한 방법으로 lentivirus 배양 상등액 상에 존재하는 p24 virus core/capsid protein의 양을 ELISA법으로 측정한다. Lentivirus 상등액 샘플은 p24에 정량적으로 결합하는 anti-p24 antibody가 코팅되어 있는 96-well microtitration plate (12 x 8-well strips)의 각 well에 분주하였다. 결합된 p24를 biotinylated anti-p24 secondary antibody, streptavidin-HRP (horseradish peroxidase), 발색 시약의 조합을 사용하여 검출한다
표준 곡선을 사용하여 계산된 p24 값을 바이러스 입자 또는 감염성과 연관시켜 바이러스의 양을 계산할 수 있다.