CAR-T cell 연구 개발 및 T cell 분화실험을 위한 새로운 T cell 확대배양 Solution
- Naive T cell 비율이 높은 확대배양법 - Naive한 T-cell의 비율이 높은 방법
- 간단한 프로토콜 - 2주면 완성되는 간단한 T-cell 확대배양법
Introduction
T lymphocyte (T cells)는 항원에 대한 특이적인 면역반응에서 주요한 역할을 하여 바이러스에 감염된 세포나 악성 세포 등을 인식하여 직접 죽이는 역할을 한다. 이러한 세포는 혈액에서 분리되어
ex vivo에서 배양하면 cancer therapy (예. in adoptive cell therapy with chimeric antigen receptors)에 사용될 수 있으나 유전적으로 조작하거나 치료에 사용할 만큼 확대배양 하는 것에 어려움이 있다.
in vitro에서 T-cell 확대배양은 interleukin 2 (IL-2) 성장인자와 anti-CD3 monoclonal antibody (OKT3 clone)를 같이 사용하는 것으로 효율을 높일 수 있다. 이때 CD3 pathway의 activation은 T-cell이 IL-2에 민감하게 반응하도록 만들어 세포분열을 유도한다. 또한, anti-CD3는 T-cell 표면에 CD3 complex와 관련된 receptor를 파괴하여 antigen receptor를 활성화시킨다 (Tsoukas et al. 1985). 이때 IL-2, anti-CD3 antibody와 함께 RetroNectin
®을 사용하면 VLA-4, VLA-5 integrin을 자극해서 CD8+ T-cell의 확대배양을 촉진하고, T cell의 multifunctionality와
in vivo memory 형성을 촉진한다 (Hosoi et al. 2014). 따라서 RetroNectin
®을 사용하면 PBMC (peripheral blood mononuclear cells)로부터 naive한 CD8+ T cell을 더 많이 확대배양할 수 있고, 유전적으로 변형된 T-cell의 확대배양 효율을 높이고 변형된 유전자의 지속성을 높일 수 있다 (Yu et al. 2008).
RetroNectin® Recombinant Human Fibronectin Fragment (Code T100A/T100B)와
RetroNectin® GMP grade (Code T202)는 lentivirus 또는 retrovirus의 transduction enhancer로 transduction 효율이 낮은 cell에 적용하기 위해 많이 사용되고 있다. 이 컨텐츠에서는 transduction enhancer 이외 PBMC로부터의 Naive한 T-cell을 높은 비중으로 배양할 수 있는 확대배양 application에 대해 안내한다.
그림 1. T-cell의 추출 및 연구과정
다카라코리아 T-cell 확대배양 관련제품
Solution 1. T cell 확대배양의 새로운 Solution
RetroNectin® Recombinant Human Fibronectin Fragment (Code T100A/B)
- 기존의 확대배양법 (Anti-CD3/Anti-CD28) 대비 향상된 확대배양 효율*1
- 확대배양 후에도 Naive T cell 비율 유지
- CAR-T cell 연구에 최적: T cell에 도입된 유전자의 장기간 발현*1 및 multi-function 강화*2
- RetroNectin® GMP grade (Code T202)으로 임상 적용도 가능
*1 Yu, S. S., et al. "In vivo persistence of genetically modified T cells generated ex vivo using the fibronectin CH296 stimulation method."
Cancer gene therapy 15.8 (2008): 508.
*2 Hosoi, Hayato, et al. "Stimulation through very late antigen-4 and-5 improves the multifunctionality and memory formation of CD8+ T cells."
European journal of immunology 44.6 (2014): 1747-1758.
그림 2. RetroNectin® (RN)을 anti-CD3와 IL-2와 같이 사용하여 4일 간 확대배양한 결과, 기존 방법 대비 T cell의 생장을 1.5배 증가시키며, Naive T cell의 비율도 높게 유지되었다. Peripheral blood T cell을
in vitro에서 anti-CD3 antibody (OKT3 clone)와 IL-2를 사용해서 10일간 확대배양 한 결과 RN을 같이 사용한 경우, RN을 사용하지 않은 경우 보다 대략 두배 더 많은 naive T cell (CD45RA+/CCR7+ phenotype)을 생산할 수 있었다.
Solution 2. 합리적이고 고품질인 Anti-CD3 mAb GMP grade 사용하세요.
Anti-CD3 mAb GMP grade (Code T210)
- T cell 확대배양에 가장 많이 사용하는 OKT3 Clone 사용
- RetroNectin®과 함께 사용하면 확대배양 효율을 최대로 향상
- 1 ㎎/㎖의 대용량으로 합리적인 가격에 사용
- GMP grade로 임상연구에 사용 가능
(A) 세포 증식률
(B) 표현형 (CD3/CD4/CD8 비율)
(C) K562세포에서 세포 독성 측정
그림 3. T cell 확대배양에서 OKT3의 성능 비교. Peripheral blood mononuclear cell (PBMC)을 Anti-CD3 mAb로 자극하며 5일간 배양하고, T cell 배지에 적절히 희석하면서 9일간 추가 배양하였다. 확대배양 후 (A) 세포 증식률, (B) 표현형 (CD3/CD4/CD8 비율), (C) K562세포의 세포 독성 활성을 비교한 결과, Anti-CD3 GMP grade의 타사 제품과 동등한 성능을 확인하였다.
Solution 3. 배양용기만 바꿔도 세포 배양 효율 up!
CultiLife™ 215 Culture bag (Code FU0005) &
GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag (Code FU0010)
- 가스 투과성 culture bag으로, 플라스크 배양 대비 높은 세포 배양 효율
- Closed cell culture system으로 사용자에 의한 오염 최소화
- 투명한 재질로 광학현미경으로 세포 관찰 가능
그림 4. 배양용기에 의한 T cell 증식속도 비교. Human PMBC (Peripheral blood mononuclear cell)를 Anti-CD3 mAb의 존재 하에서 4일간 배양 후, 4종류의 T cell 배양배지에 희석하여 추가로 15일간 배양하였다. GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag을 사용한 결과, 어떤 배지를 사용하여도 기존 플라스크 배양보다 높은 세포 증식률을 보였다.
Solution 4. Xeno-Free, Serum-Free T cell 전용 배양 배지 사용으로, 확대배양 효율 증가
LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium, 1L Bottle (Code WK552S)
- Anti-CD3 antibody와 IL-2의 존재 하에서 T cell의 높은 증식율 유지
- Xeno-Free, Serum-Free로도 높은 성장성 유지
(Human serum albumin (pharmaceutical-grade) 및 recombinant human insulin 포함)
- Endotoxin 검사완료 (endotoxin 0.3 EU/㎖ 이하) 및 mycoplasma, 무균 시험 완료
그림 5. 다양한 serum-free 배양배지를 사용한 T cell 확대배양 비교. 두 명의 기여자의 혈액에서
PBMC (Peripheral blood mononuclear cell)를 분리하여 Anti-CD3 monoclonal antibody와 IL-2의 존재 하에 4가지 배지를 사용하여 (LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium, GT-T551 (Takara), X-VIVO 15 (Lonza), AIM V (Thermo Fisher Scientific)) 4일간 CultiLife 215 Culture Bag에서 배양하였다. 이후 IL-2가 추가된 각 배지에 적절히 희석 후 10일동안 추가로 배양하였다. 그 결과 14일 후 LymphoONE™ 배지에서 배양된 세포가 다른 세가지 배지에서 배양된 세포보다 더욱 높은 증식율을 보였다.
Total Solution. RetroNectin®을 사용한 T-cell 확대배양 workflow
그림 6. RetroNectin®, LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium, CultiLife™ bag, anti-CD3 mAb를 사용한 T cell 확대배양 프로토콜.
