Adeno-associated virus (AAV)는 Parvovirus 과의 Dependovirus 속에 포함되는 non-envelope의 ssDNA 바이러스로 분열세포와 비분열세포 모두에 유전자의 도입이 가능하다. 또한 사람에게 병원성이 없다고 알려져 있고 helper virus의 존재시에만 증식한다는 특징이 있어 in vivo 실험에서 많이 사용되고 있다. 이러한 특징들로 AAV는 다양한 cell type에 적용 가능한 유전자 도입 tool로 기대되고 있으며 gene therapy 분야에서도 다양하게 활용되고 있다.

재조합 AAV 벡터의 특징

• Helper free 시스템을 사용하면 간단하게 고역가 생산이 가능
• 재조합 AAV 벡터는 숙주 세포의 genome으로의 삽입 (integration)이 발생하지 않음
• 비분열 세포에서 도입 유전자의 장기간 발현이 가능

AAV의 serotype

■ Step 0: AAV workflow
그림 1. AAV 생산을 위한 workflow.

AAV 실험은 AAV의 생산부터 추출, 정제, 역가측정, 도입 (transduction) 순서로 진행된다. AAVpro^® 시리즈를 사용하면 AAV의 생산부터 역가측정 까지의 단계를 진행할 수 있으며 transduction에 사용하기 위한 AAV를 얻을 수 있다.

■ Step 1: 목적 유전자 (GOI)의 cloning
AAVpro^® Helper Free System (Code 6230 외)에 포함된 pAAV-CMV Vector에 목적 유전자 (GOI)를 cloning 한다 (목적 유전자 크기 2.5kb 이내).
- 간편한 cloning을 위해 In-Fusion^® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)를 같이 사용하는 것을 추천한다.
- In-Fusion^® Cloning 기술 보기

■ Step 2: AAV 생산
AAVpro^® Helper Free System (Code 6230 외)은 helper virus를 사용하지 않는 AAV 생산 시스템이다. 제품에 포함된 pAAV-CMV Vector (발현하고자 하는 유전자를 cloning), pRC Vector, pHelper Vector를 AAVpro^® 293T Cell Line (Code 632273)에 TransIT-VirusGEN^® Transfection Reagent (Code MIR 6700)을 사용하여 transfection 후 2~3일간 배양한다.

필요한 제품

AAVpro^® Helper Free System (AAV2) (Code 6230) 특징

■ Step 3: AAV 추출
transfection 후 2~3일간 세포를 배양한 후 AAV를 추출한다. 이때 일반적으로 freeze-thaw 법이나 초음파 기기를 사용하는 방법이 사용되나 이러한 방법들은 시간이 오래 걸리고 초음파 기기 등의 장비가 필요하다. 이때 AAVpro^® Extraction Solution (Code 6235)를 사용하게 되면 간단하게AAV를 추출할 수 있다.

AAVpro^® Extraction Solution (Code 6235) 특징

• 일반적인 freeze-thaw 방법과 비교해서 3배 이상의 AAV 회수 가능 (그림 4.)
• 세포 유래 핵산이나 단백질 혼입이 낮은 AAV 추출 가능
• 추출된 AAV는 purification 이후 cell infection에 사용할 수 있다.*
  * in vivo 실험에는 AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6666)등의 제품을 추천한다.

그림 4. AAVpro^® Extraction Solution과 freeze-thaw 방법의 AAV 추출 효율 비교.
AAV2를 packaging cell에서 (A) AAVpro^® Extraction Solution으로 추출한 경우와 (B) freeze-thaw 방법으로 추출한 경우이다. 추출된 AAV의 역가는 qPCR로 측정되었다.

■ Step 4: AAV 정제
높은 transduction 효율을 얻기 위해서 AAV의 purity가 매우 중요하다. 일반적으로 ultracentrifuge를 활용한 정제 방법이 사용되고 있으나 시간이 오래 걸리고 높은 수율을 얻기 위해서는 숙달된 기술이 필요하다. 다카라의 아래 제품을 사용하면 간단한 프로토콜로 최대 4시간 안에 AAV를 추출부터 정제까지 한번에 진행할 수 있다.

• 다양한 serotype에 적용 가능한 간단한 프로토콜 정제 Kit (precipitation & filtration protocol)
• in vivo 실험에 최적인 고순도의 AAV 정제 가능

■ Step 5: AAV 역가 측정
AAV의 역가측정은 일반적으로 DNA blotting이나 ELISA로 진행되나 AAVpro^® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233)을 사용하면 Real-Time PCR을 통해 바이러스 DNA의 양을 단시간에 높은 정확도로 측정할 수 있다. 이 제품은 Real-Time PCR로 AAV 역가를 측정하기 위한 모든 시약이 포함되어 있어, packaging cell에서의 AAV 추출부터 Real-Time PCR법 정량까지 약 2.5시간만에 마무리된다.

• 다양한 serotype의 AAV에 적용 가능*
• DNA blot이나 ELISA법 대비 더욱 정확한 결과
  * AAV의 serotype은 바이러스 생산에 사용하는 pRC Vector에 코딩된 Cap 유전자의 유형에 의해 결정된다. 반면 AAV안에 들어간 genome은 일반적으로 serotype에 관계없이 AAV2 ITR을 공통적으로 사용한다. 이 제품은 AAV2 유래의 ITR 서열을 타겟하기 때문에 AAV의 expression vector에 ITR 영역이 AAV2 유래인 경우 serotype에 관계없이 적용이 가능하다.

그림 5. 각각 IRT 서열과 CMV promoter 서열을 타겟한 qPCR로 AAV 역가 측정 결과.
두가지primer set으로 (CMV region, ITR region) AAV1, AAV2, AAV6의 viral genomic titer를 측정한 결과 모든 serotype에서 비슷한 수준의 viral genomic titer가 확인되었다.