문제점

가능한 원인

검토 사항

1. 발현이 되지 않음

Vector construction 문제

In frame 으로 정확하게 클로닝 되었는 지 sequencing으로 확인한다.

낮은 transformation 효율

Plasmid miniprep 진행하고, sequence를 확인한다.

세포 회수 전에 induction 시약을 넣지 않음

적정량의 induction 시약을 넣는다.

2. 낮은 발현 레벨

불용성으로 과발현된 단백질

변성 조건에서 추출, 정제를 진행하거나, induction 시약의 처리량을 줄여 발현 수준을 낮춘다.

적절하지 않은 발현 조건

세포 생장과 induction 시약의 농도를 확인한다.
형질전환 되지 않은 세포나 항생제 내성 세포가 포함되었을 가능성을 체크한다.

분비형 단백질

적절한 완충 후 배양액 (fermentation liquid) 또는 혈청 (Thiophilic Resin용)을 정제용 시작 샘플로 사용한다.

문제점

가능한 원인

검토 사항

1. 단백질이wash buffer로 용출되는 현상

Vector 구축 문제

단백질과 tag가 in frame으로 구성되었는지 확인한다.

Buffer가 적절하지 않은 경우

모든 buffer의 pH와 조성을 확인한다.
모든 washing 단계에서 강도가 낮은 wash buffer를 사용한다.
예)
Wash buffer의 pH를 약간 높여준다.
Imidazole 농도를 낮춰준다.
Sulfate 염 농도를 높여준다 (Thiophillic Resin의 경우).

정제과정에서 단백질이 분해된 경우

1) 첫번째 정제 단계를 빠르게 진행한다.
2) 단백질 분해효소 억제성분 (예, β-ME와 EDTA)이 포함된 4℃의 마일드한 조건에서 추출한다. TALON resin에 로딩하기 전에 반드시 EDTA는 제거한다.
3) 발현된 단백질의 경우 C-말단 구조를 만들어준다.

시약이 결합을 방해한 경우

1) 각 정제키트의 시약 호환성 (Reagent Compatibility)를 확인한다.
2) Lysate (1:10)를 희석하거나, sonicate 하여 소량 샘플로 결합을 먼저 확인한다.
3) 컨트롤로 다른 his-tagged protein을 테스트 해 본다.

Native 조건에서 tag가 결합하지 않는 경우

1) TALON Resin의 경우: Native 조건 하에서 단백질이 결합하지 못하는 경우, 소량 샘플을 우선 테스트 정제하여 SDS-PAGE로 확인해본다.
만약 타겟 단백질이 레진에 결합한다면, native 조건에서 tag가 더 많이 노출될 수 있는 단백질의 위치로 tag 서열을 옮긴다.

2) GST의 경우: GST가 변성되었을 가능성을 확인한다.

2. 샘플을 로딩하는 동안 높은 역압력이 발생하는 현상

DNA 존재로 인해 점도가 높은 경우

1) DNase I을 처리한다

2) 샘플을 컬럼에 로딩하기 전에 5배 가량 희석한다.

문제점

가능한 원인

제시되는 해결방안

1. 많은 양의불순물이 같이 용출되는 현상

충분하지 않은 washing 과정

더 많은 양의 Equilibration/Wash Buffer를 사용한다.

Buffer 조성이 적합하지 않은 경우

1) 샘플 준비 및 wash 단계에 사용했던 buffer를 체크한다.
2) pH를 체크한다. Equilibration/Wash Buffer는 반드시 pH 7.0 이어야 한다. 오염성분은 pH < 7.0 인 buffer에서 용출될 수 있다.
3) Wash buffer의 사용량을 늘리고 A280 값이 0으로 될 때 까지 resin을 wash한다.
4) 비특이적 이온 결합을 억제하기 위해 반대이온 (counterion) 농도를 최대 0.5M NaCl (또는 KCl) 까지 높인다.
5) 소량의 nonionic detergent를 추가한다.
; 이것은 진핵생물 발현 시스템에서 단백질을 정제할 때 특히 중요하다.
6) TALON Resin 의 경우: 에틸렌 글리콜 또는 글리세롤을 추가하여 비특이적인 소수성 결합을 막는다.
7) TALON Resin 의 경우: 1~5 mM imidazole 을 Equilibration/Wash Buffer에 넣고 elution 직전 wash 단계에서 사용한다.

Resin이 과도하게 사용된 경우

Lysate 샘플의 재조합 단백질 양을 추정하고 필요한 양 만큼의 resin만 사용한다 (각 resin별 capacity 확인).

단백질 분해산물

4℃에서 단백질 분해 저해제 (예, β-ME, EDTA)를 포함하는 마일드한 조건으로 정제한다.
EDTA는 TALON 사용 전에 반드시 제거한다.

단백질에 불순물의 공유결합(Cys-Cys, disulfi debonds)

5~10 mM의 β-ME 을 Equilibration/Wash Buffer에 넣어 사용한다 (Thiophilic Resin은 해당되지 않음).

히스티딘(TALON에 해당) 또는 sulfone (thiophilic에 해당)이 많은 단백질

1) HAT- 또는 polyhistidine tagged 단백질은 enterokinase 를 사용하여 HAT tag을 제거하고 다시 IMAC을 실시한다. 타겟 단백질은 컬럼을 통과하고 불순물과 태그는 흡착된다.
Note: 단백질 분해 혼합물을 TALON Resin에 로딩하기 전에 gel filtration을 통해 chelating ligand 를 제거한다.

2) Buffer의 pH가 적절한 지 확인한다.
3) Size exclusion, 이온 교환, 소수성 크로마토그래피 등과 같은 2차 정제 방식을 사용한다.

단백질 샘플이 너무 농축되어 있거나 점성이 높은 경우

샘플을 적절한 buffer에 1:5 또는 1:10으로 희석하고 사용 전에 원심분리 한다.
DNase I을 처리하는 등 sonication 후 샘플 점성 줄이는 방법을 검토한다.

2. TALONspin 컬럼 사용 후 과도한 background

샘플의 점성이 너무 높은 경우

1) DNase I을 처리한다
2) 동량의 Equilibration/Wash Buffer를 넣고 샘플을 희석하여 두 개의 튜브로 나눈다.
3) 1 ml washing 횟수를 늘린다.
4) Equilibration/Wash Buffer (pH 7.0)을 사용한다.
5) 1~5 mM imidazole을 Equilibration/Wash Buffer, pH 8.0에 넣고 elution 직전 wash 단계에서 사용한다.
6) TALONspin 샘플을 재정제하려면 TALON Purification Section VI.B: Step 37 를 수행한 후 다음을 진행한다.
(1) 반정제된 샘플의 4배 부피의 equilibration/wash Buffer를 추가한다.
(2) 샘플을 다른 TALONspin 컬럼에 로드한다.
(3) Equilibration/wash Buffer 1 ml로 두 번 세척한다.
(4) 이전과 같이 용출한다 (섹션 VI.B.30-35).

3. 컬럼이 중단되는 현상

세포 잔여물로 필터가 막힌 경우

컬럼 필터를 교체하고, 샘플을 4°C, 12,000 x g에서 20~30분 동안 원심분리한다.

컬럼에 침전된 단백질

Equilibration/Wash Buffer에 decanoyl-N-methylglucamide (MEGA-10, Sigma, Cat. No. D-6277)와 같은 마일드한 detergent를 사용한다.

레진의 하부가 세포 잔여물로 인해 막히는 경우

1) 막힌 컬럼에서 레진을 제거하여 resuspension 한다. 그런 다음 batch 형태로 그것을 wash 하여 새로운 컬럼에 옮겨준다.
2) wash buffer로 채워진 주사기를 사용하거나 펌프를 뒤로 작동해서 컬럼을 부드럽게 역행시켜준다. 그런 다음 같은 방법으로 튜브 막힘을 테스트한다. 약하게 압력을 가하고, 1 drop/sec 유속을 초과하지 않는다.

4. Polyhistidine-tagged 단백질이 정제되지 않는 현상

Elution buffer가 적절하지 않은 경우

1) 150 mM imidazole 또는 pH 4.0 buffer로 elution 한다.
2) TALON의 경우: 다른 방법으로 용출되지 않는 경우, 100 mM EDTA (pH 8.0)을 사용하여 단백질을 회수할 수 있다. 그러나 이런 경우 코발트 이온이 제거되면서 단백질 샘플도 함께 침전될 수 있다.
3) Thiophilic Resin에는 해당되지 않음: 1~5 mM의 β-ME을 첨가하면disulfide 결합을 줄일 수 있다. 1% nonionic detergent 로 buffer를 보충한다.
4) Polyhistidine-tagged 단백질을 변성 (denature) 조건에서 정제한다.

문제점

가능한 원인

제시되는 해결방안

1. Co²⁺ 이온 유실

샘플 내에 chelator가 존재할 때

샘플을 gel filtration 하여 chelator를 제거하고, TALON Resin Section VIII.D.에 안내된 바와 같이 TALON Resin의 흡착제 (absorbent)를 재생시킨다.

2. 레진 색깔이 회색 또는 갈색으로 변하는 현상

TALON 레진이 환원제나 고농도의 β-ME에 과다 노출된 경우

DTE, DTT와 같은 환원제를 완전히 제거하거나 β-ME 존재 하에 gel filtration 크로마토그래피를 사용하여 제거한다.
β-ME 농도를 줄인다 (≤5mM).

3. 레진 입자가 뭉치거나 일정해보이지 않는 현상

DNA crosslinking

1) 500 mM 이하의 NaCl을 사용하여 완충액의 이온 강도를 높인다.
2) DNA를 로딩하기 전에 샘플을 강하게 sonication 한다.
3) 샘플을 100 ㎍/㎖ DNase I로 30°C, 30분 동안 전처리한다.
4) 컬럼에 로딩하기 전에 샘플을 완충액으로 1:5~1:10으로 희석한다.
5) 변성제에 레진을 장기간 보관하지 않는다.

문제점

가능한 원인

제시되는 해결방안

1. Silver-stained gel에서 백그라운드가 높게 나타남

핵산 오염

1) 0.5 M NaCl 또는 KCl을 버퍼에 첨가하고 다시 정제과정을 진행한다.
2) DNA를 더 강하게 절단한다 (shear).
3) 정제 과정에 DNase I을 사용한다.

2. 기능을 하지 않는 단백질의 정제

Sonication에 의해 단백질이 손상된 경우

1) 시간별 테스트를 통해 단백질/효소의 기본 기능을 유지하며 세포를 깨는 sonication 최소 처리 시간을 결정한다.
예를 들어 0초, 20초, 30초 동안 샘플을 sonication하고 각 단백질 또는 효소의 기능 분석을 수행하고 각 샘플의 A₂₈₀값을 측정한다.
2) 얼음위에서 세포 용해 또는 sonication 실험을 진행한다.

단백질이 분해된 경우

1) 4°C 에서 단백질을 정제한다.
2) 첫번째 과정에서 정제 시간을 줄인다.
3) 단백질 분해 저해제를 추가하고 각기 다른 단백질 분해제를 테스트해본다.

단백질 folding이 적절하지 않았을 때

변성 (denature) 조건에서 단백질 정제를 시도하고 그런 다음 refolding 과정을 추가하는 것을 검토한다 (Lin et al., 2007).

문제점

가능한 원인

제시되는 해결방안

1. 결합용량이 일반 수준보다 낮은 현상

용해물에 자연적으로 발생하는 환원제가 포함되어 있거나 비특이적 다중음이온이 금속 결합 부위를 가렸을 경우

1) 이전 보다 더 많은 양의 레진을 사용한다.
2) 사용한 레진을 새 레진으로 교체한다.
3) TALON의 경우: 레진을 6 M guanidinium (pH 5.0) 및 1% Triton X-100 또는 SDS로 세척하고 사용하기 전에 다시 equilibrate 한다.

레진이 더럽거나 완전히 재생되지 않았을 때

1) 레진이 손상되었거나 마모된 경우
이러한 레진은 적절한 조치 및 재생 과정을 통해 재사용이 가능하나, 무한정 사용할 수는 없다.
TALON 레진은 최소 3~5회 재사용할 수 있다.
2) Thiophilic Resin은 적절히 관리하면 10회 이상 재사용이 가능하다.
3) Glutathione Resin은 최소 5~10회 재사용할 수 있다.

단백질이 활성화되려면 번역 후 변형과정이 필요한 경우

이런 경우 발현 시스템을 변경해야 할 필요가 있다.
(예, E. coli에서 곤충 또는 포유류 세포 시스템으로 전환)