Co-transcriptional capping은 IVT (in vitro transcription) 반응 시 cap analog를 넣어서 mRNA가 합성되는 동시에 5’ 말단에 cap analog가 끼어들어가도록 하는 방법이다. 이를 위해 cap analog에 호환되는 각각의 transcription start site가 template plasmid에 필요하다. 현재 시장의 메인이 되는 co-transcriptional capping 기술은 CleanCap^® (TriLink BioTechnologies)와 ARCA (Anti-reverse cap analog)이고, 둘 다 Takara IVTpro™ 시리즈와 같이 사용할 수 있다.

■ 각 capping 기술 요약
CleanCap^®과 ARCA (Anti-reverse cap analog) 방법은 각각 장단점이 있다. 이는 연구자의 필요에 따라 선택하여 사용할 수 있다.

CleanCap^®은 가장 최신 세대의 cap analog로 cap-1 구조의 mRNA를 단일 step으로 합성할 수 있다. 그러나 상대적으로 고가이고, 특허 및 라이선싱을 고려해야 한다. 반면, ARCA는 상대적으로 저렴하고 라이선싱 문제가 없으나 cap-0 구조의 mRNA를 합성한다. 따라서 추가적인 반응으로 mRNA 2’-O-methyltransferase 등의 enzyme을 사용해 cap-1구조로 변환해야 한다. 또한 ARCA의 capping efficiency (50~80%)는 CeanCap^®의 capping efficiency (>95%)와 비교하면 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다.

■ CleanCap^® approach
Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143) 혹은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)의 Linearized Template Vector는 transcription start site인 (그림 1) AGG 서열을 가지고 있다. 이는 CleanCap^® Reagent AG (No. N-7113 or N-7413)에 호환되는 서열이다.

CleanCap^® Reagent를 같이 사용하는 IVT 프로토콜과 vector에 대한 자세한 정보는 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141) 혹은 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)의 사용자 매뉴얼을 참고 바랍니다.


그림 1. Linearized Template Vector의 Transcription start site. AGG 위치는 붉은 색으로 표시되었다. 이 vector는 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143) 혹은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에 포함되어 있고 CleanCap^® Reagent AG (No. N-7113 or N-7413)에 호환된다.

■ ARCA approach
만약 ARCA를 사용해서 co-transcriptional capping을 한다면 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에서 transcription start site를 변경해야 한다. 이때 Linearized Template Vector의 start site (+1 position)을 A에서 G로 변경한다 (그림 2).


그림 2. transcription start site의 변경. Cap analog는 co-transcriptional capping을 위해 각각 다른 transcription start site를 필요로 한다. Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143) 혹은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에 포함되어 있는 Linearized Template Vector는 ARCA를 적용하기 위해서는 AGG에서 GGG (붉은색)로 변경해야 한다.

■ 관련제품
- Template 준비부터 IVT까지 고품질 고수율 시스템 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)
- mRNA 전용 Transfection 시약, TransIT^®-mRNA Transfection Kit (Code MIR 2250)
- IVT전 vector의 선형화에 사용하는 Type IIS 제한효소 BspQ I (Code 1227A)
- BspQ I과 같이 사용할 수 있는 IVT용 Template Vector: Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis (Code 6146)
- Cloning시 CDS서열을 정확하게 PCR: PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Code R050A)