Post-transcriptional capping은 IVT (in vitro transcription)으로 mRNA를 합성한 이후 5’-말단을 enzyme으로 modification하는 방법이다. Enzymatic capping라고도 부르며, 특허가 없기 때문에 상대적으로 비용이 저렴하고 매우 높은 capping efficiency를 가지고 있다(80~100%) (Grudzien et al., 2004).

■ Reagents
Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A) (VCE)은 7-methylguanylate cap 구조 (m⁷G 혹은 Cap-0)를 uncapped mRNA의 5’ 말단에 부가한다. 이 제품에는 capping 반응을 위해 필요한 모든 시약들 (10x Capping Buffer, GTP, S-adenosylmethionine (SAM))이 포함되어 있고 모든 실험을 한시간 내에 완료할 수 있다.

Component	Concentration	Size*
Vaccinia Capping Enzyme	10 U/㎕	500 U
10x Capping Buffer	10x	100 ㎕
S-adenosylmethionine (SAM)	32 mM	100 ㎕
GTP	10 mM	50 ㎕

*500 U의 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)는 50 x 20 ㎕ 만큼의 반응액에 사용할 수 있다.

mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (Code 2470A) (2’-O-MTase)는 SAM을 methyl donor로 사용하여 mRNA의 5’ 말단의 첫 nucleotide (+1)의 2’-O 위치에 메틸기를 추가해 cap-1 구조를 형성한다.

Component	Concentration	Size*
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase	50 U/㎕	2500 U
10X Capping Buffer	10X	100 ㎕
S-adenosylmethionine (SAM)	32 mM	100 ㎕

*2500 U의 mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (Code 2470A)는 50 x 20 ㎕ 만큼의 반응액에 사용할 수 있다.

■ Procedure: VCE and 2'-O-MTase, one-step vs. two-step protocol
Post transcriptional capping은 mRNA에 cap-0 구조를 추가한 뒤 cap-1 구조로 변경하기 때문에, VCE (uncapped RNA -> cap0 RNA)와 2'-O-MTase (cap0 RNA -> cap1 RNA)을 순차적으로 사용한다 (2-step reaction; 그림 1). 그러나 아래와 같이VCE의 capping과 2'-O-MTase의 methylation을 동시에 진행하기도 한다 (1-step reaction; 그림1). 이에 대한 자세한 내용은 각 제품페이지와 사용자 매뉴얼을 참고할 수 있다.


그림 1. Post-transcriptional capping 방법. Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A) (VCE)와 mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (Code 2470A) (2’-O-MTase)를 사용하는 capping법은 1-step과 2-step 두 가지 방법으로 진행될 수 있다. 자세한 내용은 사용자 매뉴얼을 참고할 수 있다.

■ 관련제품
- Template 준비부터 IVT까지 고품질 고수율 시스템 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)
- Transformation 과정에서 Poly(A) 같은 반복서열이 결손 되지 않는: Takara Stable Competent Cells (Code 9132)
- mRNA 전용 Transfection 시약, TransIT^®-mRNA Transfection Kit (Code MIR 2250)
- IVT전 vector의 선형화에 사용하는 Type IIS 제한효소 BspQ I (Code 1227A)
- BspQ I과 같이 사용할 수 있는 IVT용 Template Vector: Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis (Code 6146)
- Cloning시 CDS서열을 정확하게 PCR: PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Code R050A)
- 임상분야 연구개발에 적합한 dsRNA 혼입이 적은: PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)