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dsRNA 생성이 적어 임상분야의 연구개발에 적합한 고품질 mRNA 합성

PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2560A	PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)	20,000 U	333,000원

Product index

in vitro transcription

IVT (in vitro transcription)에서 RNA 합성 시 발생하는 double stranded RNA (dsRNA) 생성을 크게 억제해 생체투여 시 면역원성 감소
CleanCap^® Reagent AG (TriLink 사)등의 cap analog와 같이 사용해 capping 효율이 높은 고수율 RNA 합성 가능
기존 제품 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)에 비해 내열성을 높여 (~52℃) 다양한 조건에서 반응 가능

제품설명

PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)는 T7 RNA Polymerase^*1를 업그레이드하여, 최저로 dsRNA 생성을 억제한 Cap analog dependent한 RNA합성이 가능하고, 내열성 (~52℃)을 가지도록 개량되었다. 이 효소를 CleanCap^® Reagent AG등의 cap analog와 같이 사용하면 높은 capping 효율과 고수율 mRNA 합성이 가능하며, 동시에 dsRNA로 인해 발생하는 면역원성을 크게 줄일 수 있다. 고품질의 mRNA를 대량으로 제조할 수 있기 때문에 백신과 같은 RNA therapy 분야의 연구 개발에 적합하다.

^*1 NTP를 기질로 double-stranded DNA에서 T7 promoter의 downstream 영역을 RNA로 합성 (transcription)하는 효소.

일반적인 T7 promoter 서열 및 transcription start site (CleanCap^® Reagent AG 사용 시 주의사항)
IVT를 위해 필요한 template DNA의 일반적인 T7 promoter 서열은 아래 그림과 같다. 단, 합성하고자 하는 RNA 염기 서열의 특징과 cap analog 사용 여부에 따라 template을 다르게 설계해야 한다.

[CleanCap Reagent AG 사용시]
Transcription start site (+1)의 NGG서열을 AGG로 설계하는 것을 권장

[uncapped RNA를 합성하거나 ARCA를 사용하는 경우]
Transcription start site (+1)의 NGG서열을 GGG로 설계하는 것을 권장

그림 1. FLuc mRNA (약 1.9 kb)의 합성 수율 (A), dsRNA 생성율 (B) 및 dsRNA의 비율 (C)
Positive Control Template (FLuc) (Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)의 구성품)을 주형으로 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)와 본 제품을 사용해 mRNA 합성 을 비교한 결과 (20 ㎕, 사용예 참고), 본 제품이 mRNA 합성 수율의 저하 없이 dsRNA 생성율을 90% 이상 감소시키는 것을 확인할 수 있다.

그림 2. Cap analog의 농도 별 mRNA 합성 수율 (A), Capping 효율 (B) 및 단백질 발현율 (C).
Positive Control Template (FLuc)을 주형으로 다양한 농도의 CleanCap Reagent^® AG (0, 2, 4, 6, 8 mM)와 본 제품 또는 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)으로 FLuc mRNA (약 1.9 b)를 합성하고 수율을 측정하였다. 이후 합성된 mRNA는 LC/MS로 capping 효율을 측정하였고, HEK293 cell에 transfection해 FLuc assay로 단백질 발현량을 측정했다. 그 결과, 본 제품은 CleanCap^® Reagent AG 농도에 비례하여 mRNA 합성 수율이 증가하였고, 저농도의 CleanCap Reagent AG에서도 높은 capping 효율을 보였으며, 다양한 조건에서 단백질 발현율이 높은 mRNA를 합성하였다.

그림 3. IVT 반응시 생성되는 dsRNA의 예
일반적인 T7 RNA Polymerase는 RNA 합성 과정에서 발생하는 짧은 단편의 ssRNA 혹은 RNA 말단에 비특이적으로 부가되는 추가서열 (말단 전이 활성)로 인해 dsRNA가 형성되고 이는 면역원성으로 작용해 mRNA의 안전성과 효율을 감소시킬 수 있다.

보존: -20 ℃

내용

구성품	용량
PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)	20,000 U
10X T7 RNA Polymerase Buffer	1 ㎖

농도: 200 U/㎕

용도

- Cap analog를 사용한 capped mRNA 합성 (co-transcriptional capping)
- Capping enzyme을 적용하기 위한 uncapped RNA 합성 (참고; cap analog 대비 10~40% 낮은 RNA 수율)

기원

Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for phage T7 RNA polymerase variant

일반적인 성질

- 분자량: 약 99.8 kDa
- Cofactor: Mg²⁺

활성의 정의

37 ℃에서 1시간 동안 1nmol [³H] GMP를 acid-insoluble fraction에 생성하는 효소의 양을 1 U으로 한다.

활성 측정용 반응액의 조성

40 mM		Tris-HCl, pH 8.0
8 mM		MgCl₂
2 mM		spermidine)
5 mM		DTT
0.4 mM		ATP, UTP, and CTP
0.4 mM		[³H]GTP
1 ㎍/50 ㎕		pT7-2 DNA

주의사항

1. 과도한 vortexing을 삼가해 주세요.
2. Template DNA나 반응에 사용되는 tube, micro-pipette 등이 RNase에 오염되어 있는 경우 RNA의 수율이 낮아지거나 단편이 분해될 수 있습니다. RNase free tube 및 micro-pipette을 사용하고 일회용 장갑을 사용해 주세요.
3. 일정한 길이의 RNA 합성을 위해 선형화된 plasmid 혹은 PCR 산물같은 linearized dsDNA를 사용해야 하며, 원치 않은 형태의 RNA 합성을 방지하기 위해 template DNA의 3’ 말단은 5’-protruding 혹은 blunt 형태를 추천합니다.
4. 10X T7 RNA Polymerase Buffer는 spermidine이 포함되어, 핵산과 복합체를 형성해 경우에 따라 불용성으로 침전되는 경우가 있습니다. 따라서 template DNA는 반응액 조제 시 enzyme을 넣기 바로 직전에 마지막 순서로 넣는 것을 권장합니다.
5. 이 제품에는 cap analog 및 NTP (ATP, CTP, GTP, UTP)가 포함되어 있지 않으므로, CleanCap^® Reagent AG (TriLink)와 Ribonucleoside 5＇-Triphosphates (Code 4041 외)등을 준비해 주세요.
6. IVT시 RNA 합성 반응을 촉진하는 Pyrophosphatase (inorganic) (Code 2450A)와 합성된 RNA의 분해를 억제하는 Recombinant RNase Inhibitor ver.2.0 (Code 2315A)를 같이 사용하는 것을 권장합니다. 자세한 내용은 각 제품페이지를 참고 바랍니다.

사용 예

RNase-free Water		X ㎕
10X T7 RNA Polymerase Buffer		2 ㎕
ATP, CTP, GTP, UTP^*1		각 10 mM
CleanCap Reagent AG^*2		4 mM
Template DNA		0.5 ~ 2 ㎍
Recombinant RNase Inhibitor ver.2.0		20 U
Pyrophosphatase (inorganic)		0.1 U
PrimeCap T7 RNA Polymerase		200 U
Total		20 ㎕

37℃에서 1~2시간 반응
^*1 Modified NTP를 사용하는 경우 해당하는 NTP를 동량으로 대체하여 사용
^*2 CleanCap Reagent AG (TriLink BioTechnologies: Code. N-7113-1/5/10)

관련제품

- IVT용 Plasmid template을 간단하게 제작하는 Kit: Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
- Capping enzyme (uncapped RNA -> cap-0 RNA): Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)
- Capping enzyme (cap-0 RNA -> cap-1 RNA): mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)
- IVT전 vector의 선형화에 사용하는 Type IIS 제한효소: BspQ I (Code 1227A)
- BspQ I 인식서열이 있는 IVT template vector: Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis (Code 6146)
- mRNA 발현을 Boost시약이 포함된 transfection reagent: TransIT^®-mRNA Transfection Kit (Code MIR 2250)

Keyword :

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Pyrophosphatase (inorganic)

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