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Poly(A) 및 반복 서열을 포함하는 유전자의 클로닝에 최적

Takara Stable Competent Cells

-

제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 9132
 Takara Stable Competent Cells
관련학술 구매하기 LMO제품  		1 Set (100 ㎕×10)
 273,000원  9132_ds_j.pdf

제품설명
본 제품은 DNA 안정성이 향상되도록 homologous recombination과 관련된 유전자의 일부가 결손되어 있어 poly(A) 서열이나 반복 서열을 가진 불안정한 DNA를 클로닝할 때 적합하다. 따라서 Takara IVTpro™ 시리즈(Code 6141 외) 등의 IVT 실험에 매우 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, 이 제품은 T1 bacteriophage 감염에 필요한 fhuA 유전자가 결손되어 있어 해당 phage에 내성이 있다.

클로닝 시, In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947 외)의 사용을 권장하며, pUC계 벡터로 형질전환하면 blue/white colony screening이 가능하다.
ploy(A) 안정성, 반복 서열의 안정성 비교
Competent Cells
Poly(A) length [bp]
Poly(A) full length ratio
E. coli JM109
Competent Cells
105
105
43
66
105
44
105
22
27
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
32
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
48
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
46
105
45
105
81.25％
(39/48)
Takara Stable
Competent Cells
105
105
105
65
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
22
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
105
66
105
105
105
105
105
93.75％
(45/48)


그림 1. Poly(A) 안정성의 비교

105 bp의 poly(A)를 코딩하는 플라스미드 DNA를 E.coli JM109 Competent Cells (Code 9052)와 본 제품(Code 9132)에 형질전환하고 LB 플레이트에서 배양한 후, 48개의 콜로니에서 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드를 시퀀싱하여 (sanger법) poly(A)의 길이를 측정하였다. Poly(A) 탈락으로 인해 105 bp보다 길이가 짧아진 poly(A)는 빨간색으로 표시하였다.
48개 플라스미드 중 poly(A) 전체 길이를 갖는 플라스미드가 JM109에서는 39개 (poly(A) full length 비율 : 39/48=81.25%), Takara Stable Competent Cells에서는 45개 (poly(A) full length 비율 : 45/48=93.75%)이었다. 이 결과는 Takara Stable Competent Cells이 JM109보다 poly(A)를 포함하는 유전자 클로닝에 안정적이라는 것을 보여준다.


그림 2. 반복 서열의 안정성 비교
제한효소 처리로 절단 및 추출할 수 있는 32 bp × 15회와 32 bp × 20회 반복 서열을 코딩하는 플라스미드 DNA (왼쪽 그림) 를 E.coli JM109 Competent Cells (Code 9052)와 본 제품(Code 9132)으로 형질 전환하여 LB 플레이트에 배양 후 얻은 콜로니에서 플라스미드를 정제하였다.
플라스미드의 길이와 제한효소 (Sal I, EcoR V, EcoR I) 처리 시 검출되는 밴드를 아가로스겔 전기영동으로 확인한 결과, 정상적인 서열을 유지하고 있는 플라스미드가 JM109는 96개 cell 중 64개 (66.7%)인 반면, Takara Stable Competent Cells은 120개 중 97개 (80.8%) 였다. 이 결과는 Takara Stable Competent Cells가 JM109보다 반복 서열을 가진 유전자에 대해 안정성이 높다는 것을 보여준다.
구성

Takara Stable Competent Cells

100 ㎕ x 10 vials

pUC19 DNA (0.1 ng/㎕)

10 ㎕

SOC Medium*

1 ㎖ x 10 vials
* SOC Medium의 구성
2 %

Tryptone

0.5 %

Yeast extract

10 mM

NaCl

2.5 mM

KCl

10 mM

MgSO4

10 mM

MgCl2

20 mM

Glucose
보관
- 80℃
Genotype
F - , endA1 , supE44 , thi-1 , recA1 , relA1 , gyrA96 , phoA , ΔsbcCD , Φ80d lacZΔM15 , ΔfhuA , Δ(lacZYA - argF) U169 , Δ(mrr - hsdRMS - mcrBC) , ΔmcrA , λ -
( K- 12 strains of E. coli)
Cell density
1～2×109 bacteria/㎖
플라스미드 스크리닝에 사용된 항생제 및 selection 농도

항생제

Ampicillin

Kanamycin

Chloramphenicol

streptomycin

tetracycline

농도 (㎍/㎖)

100

50

20

50

20
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