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dsRNA 혼입이 적어 임상분야의 연구개발에 적합한

PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2560A	PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)	20,000 U	333,000원

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제품설명

PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)는 cap analog를 사용한 RNA 합성이 가능하고, dsRNA (double-strand RNA)의 생성율이 낮으며, 내열성을 (~52℃) 가지도록 개량된 T7 RNA Polymerase^*1이다. 이 효소는 in vitro transcription (IVT) 과정에서 CleanCap^® Reagent AG (TriLink)등의 cap analog와 같이 사용해 고효율 capping 과 고수율의 mRNA 합성을 달성하는 동시에 dsRNA의 혼입으로 인해 발생하는 면역원성을 크게 줄일 수 있다. 이를 통해 고품질의 mRNA를 대량으로 제조할 수 있기 때문에 백신과 같은 RNA therapy 분야의 연구 개발에 적합하다.

^*1 T7 promoter 서열을 주형으로, NTP를 기질로 사용해 double-stranded DNA에서 promoter의 downstream 영역을 RNA로 합성 (transcription)하는 효소.

일반적인 T7 promoter 서열 및 transcription start site (CleanCap Reagent AG 사용 시 주의사항)
IVT를 위해 필요한 template DNA의 일반적인 T7 프로모터 서열은 아래와 같다. 이때 합성하고자 하는 RNA의 염기 서열의 특징과 cap analog 사용 여부에 따라 Template을 다르게 설계해야 한다.

[CleanCap Reagent AG 사용시]
Transcription start site (+1)의 NGG서열을 AGG로 설계하는 것을 권장

[uncapped RNA를 합성하거나 ARCA를 사용하는 경우]
Transcription start site (+1)의 NGG서열을 GGG로 설계하는 것을 권장

그림 1. FLuc mRNA (약 1.9 kb)의 합성 수율 (왼쪽) 및 dsRNA 생성율 (오른쪽).
Positive Control Template (FLuc) (Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)의 구성품)과 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)으로 mRNA 합성 시 (20 ㎕, 사용예 참고), mRNA 합성 수율의 저하 없이 dsRNA 생성율을 10% 이하로 줄어드는 것을 확인할 수 있다.

그림 2. IVT 반응시 생성되는 dsRNA의 예

보존: -20 ℃

내용

구성품	용량
PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)	20,000 U
10X T7 RNA Polymerase Buffer	1 ㎖

농도: 200 U/㎕

용도

- Cap analog를 사용한 capped mRNA 합성 (co-transcriptional capping)
- Capping enzyme을 적용하기 위한 uncapped RNA 합성 (참고; cap analog 대비 10~40% 낮은 RNA 수율)

기원

Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for phage T7 RNA polymerase variant

일반적인 성질

- 분자량: 약 99.8 kDa
- Cofactor: Mg²⁺

활성의 정의

37 ℃에서 1시간 동안 1nmol [³H] GMP를 acid-insoluble fraction에 생성하는 효소의 양을 1 U으로 한다.

활성 측정용 반응액의 조성

40 mM		Tris-HCl, pH 8.0
8 mM		MgCl₂
2 mM		spermidine)
5 mM		DTT
0.4 mM		ATP, UTP, and CTP
0.4 mM		[³H]GTP
1 ㎍/50 ㎕		pT7-2 DNA

주의사항

1. 본 효소는 과도한 vortexing을 피하시기 바랍니다.
2. Template DNA나 반응에 사용되는 tube, micro-pipette 등이 RNase에 오염되어 있는 경우 RNA의 수율이 낮아지거나 단편이 분해될 수 있다. 따라서 RNase free tube 및 micro-pipette을 사용하고 일회용 장갑을 사용하는 것을 권장한다.
3. 선형화된 plasmid 혹은 PCR 산물같은 linearized dsDNA를 사용해야 일정한 길이의 RNA를 합성할 수 있다. 이때 원치 않은 형태의 RNA 합성을 방지하기 위해 template DNA의 3’ 말단은 5’-protruding 혹은 blunt 형태를 추천한다.
4. 10X T7 RNA Polymerase Buffer는 spermidine이 포함되어 있다. 이는 핵산과 복합체를 형성해 경우에 따라 불용성으로 침전되는 경우가 있다. 따라서 template DNA는 반응액 조제 시 enzyme을 넣기 바로 직전에 마지막 순서로 넣는 것을 권장한다.
5. 이 제품에는 cap analog 및 NTP (ATP, CTP, GTP, UTP)가 포함되어 있지 않다. 따라서 CleanCap^® Reagent AG (TriLink)와 Ribonucleoside 5＇-Triphosphates (Code 4041 외) 등이 별도로 필요하다.
6. IVT시 RNA 합성 반응을 촉진하는 Pyrophosphatase (inorganic) (Code 2450A)와 합성된 RNA의 분해를 억제하는 Recombinant RNase Inhibitor ver.2.0 (Code 2315A)를 같이 사용하는 것을 권장한다. 자세한 내용은 각 제품페이지를 참고 바랍니다.

사용 예

RNase-free Water		X ㎕
10X T7 RNA Polymerase Buffer		2 ㎕
ATP, CTP, GTP, UTP^*1		각 10 mM
CleanCap Reagent AG^*2		4 mM
Template DNA		0.5 ~ 2 ㎍
Recombinant RNase Inhibitor ver.2.0		20 U
Pyrophosphatase (inorganic)		0.1 U
PrimeCap T7 RNA Polymerase		200 U
Total		20 ㎕

37℃에서 1~2시간 반응
^*1 Modified NTP를 사용하는 경우 해당하는 NTP를 동량으로 대체하여 사용
^*2 CleanCap Reagent AG (TriLink BioTechnologies: Code. N-7113-1/5/10)